Физические основы фотоколориметрии. Изучение фотоэлектрического гемоглобинометра ГФ-3. Определение концентрации гемоглобина в трансформирующем растворе суспензии крови.

Синицын А.А. , Кортуков Е.В.

Цель работы:

1. Изучить принципы определения концентрации окрашенных растворов фотоэлектроколориметрическим методом.

2. Ознакомиться с устройством и работой фотоэлектрического гемоглобинометра ГФ-3.

3. Определить концентрацию гемоглобина в трансформирующем растворе крови суспензии крови.

Приборы и принадлежности:

1. Гемоглобинометр фотоэлектрический ГФ-3.

2. Набор из десяти образцов суспензии крови в трансформирующем растворе с известной концентрацией гемоглобина.

3. Два образца с неизвестной концентрацией гемоглобина.

Определение концентрации гемоглобина – ценный диагностический тест. При лабораторном определении концентрации гемоглобина используют методы концентрационной фотометрии (количественного колори-метрического анализа) различной сложности.

Простейшим вариантом колориметрии является колориметрия с использованием визуального гемометра типа ГС-3 по Сали. В основе определения концентрации гемоглобина лежит метод разведения. Соляно-кислый гематин, образующийся при смешивании крови с разбавленным раствором соляной кислоты, разбавляется в градуированной пробирке до совпадения интенсивности цвета раствора с интенсивностью цвета стандартов гемометра. Момент совпадения интенсивностей цвета фиксируется визуально. Количество гемоглобина отсчитывается по уровню разбавленного раствора и по делениям градуированной пробирки. При таком определении возникают ошибки связанные: во-первых, с ослаблением со временем жидкостных цветовых стандартов; во-вторых, с тем, что глаз человека различает интенсивности окраски лишь ³2%; в-третьих, солянокислый гематин, образовавшийся в исследуемом образце крови быстро меняет свою окраску с течением времени.

Современные методы диагностики требую более точного и надежного определения содержания гемоглобина. Разработанные в настоящее время методы фотоколориметрии и спектрофотометрии вполне удовлетворяют возросшим требованиям к точности определения концентрации гемоглобина.

Современные фотоэлектрические гемоглобинометры измеряют концен-рацию гемоглобина на основе фотометрирования высокостабильного раствора гемоглобинцианида, получающегося при действии на кровь специального трансформирующего реактива. Используемые в этих приборах фотоэлементы чувствительны к изменению интенсивности окраски раствора на 0,01%.

Применительно к определению концентрации гемоглобина в крови человека задача состоит в том, чтобы:

1. получить из образца крови стойкий окрашенный раствор гемоглобина;

2. произвести оценку оптической плотности полученного раствора;

3. по известной зависимости оптической плотности от концентрации определить содержание гемоглобина;

Теория метода

При прохождении параллельного пучка монохроматического света через поглощающее вещество (если ослабление света определяется только числом поглощающих молекул, находящихся на пути лучей и не зависит от абсолютной величины потока, а также от взаимного влияния молекул) выполняется закон поглощения света, открытый французским ученым Бугером (1729) и подробно проанализированный Ламбертом (1760). Каждый бесконечно тонкий слой однородной среды поглощает долю входящего в него светового потока, пропорциональную его толщине. Вторая закономерность была установлена Бером (1852): поглощение света тонким слоем однородной среды пропорционально концентрации поглощающих молекул.

Установленные опытным путем Бугером, Ламбертом и Бером закономерности, можно выразить одним математически выражением:

(1)

где I₀-входящий световой поток; I-выходящий поток; a- показатель поглощения света, в общем случае, зависящий от длины волны; С- концентрация; dl – элемент толщины слоя.

Интегрируя выражение (1) получим закон Бугера-Ламберта-Бера:

(2)

Закон справедлив для монохроматического света. Поэтому приборы для определения концентраций растворенного вещества снабжаются монохроматорами или светофильтрами.

При количественных измерениях следует учитывать, что часть светового потока отражается от стенок кюветы. Для разных кювет величина отраженного светового потока будет различна, а следовательно, будет и входящий световой поток I₀. Это приводит, в конечном счете, к получению несопоставимых данных. Поэтому в фотоколориметрах чаще всего используют одну и ту же кювету, поочередно заполняя ее раствором исследуемого вещества и растворителем.

На практике поглощение раствора определяют оптической плотностью D, которая по определению, равна

(3)

В соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера

(4)

где a^/- десятичный показатель поглощения.

Приборы, используемые для фотометрии (спектрофотометры) растворов обычно имеют шкалу, проградуированную в единицах оптической плотности. Поэтому для определения неизвестной концентрации раствора предварительно строят калибровочный график (зависимости измеренной на данной длине волны света оптической плотности D от неизвестной концентрации растворов С ). В соответствии с выражением (4), (если соблюдаются все предположения, сделанные при выводе закона Бугера-Ламберта-Бера) калибровочный график представляет собой прямую в некотором диапазоне концентраций растворенного вещества. Измерив оптическую плотность D_Y раствора с неизвестной концентрацией C_y по калибровочному графику находят неизвестную концентрацию C_Х.

Принцип работы и устройство фотоэлектрического гемоглобинометра гф-3.

Гемоглобинометр ГФ-3 представляет собой один из вариантов фотоэлектрокалориметра. Принцип работы прибора основан на фотометрировании света, прошедшего через раствор гемоглобина. Оптическая плотность измеряется фотоэлектрическим методом. В зависимости от содержания гемоглобина различное количество света попадает на чувствительный слой приемника лучистой энергии (кремниевого фотоэлемента). Оптическая схема – однолучевая (рис. 1)

Свет от источника (1) проходит через ограничительную диафрагму (2), цилиндрическую кювету (3), светофильтр (4) и попадает на светочувствительный слой фотопреобразователя (5). Цилиндрическая кювета обладает свойствами оптической линзы. Кювета проточная устанавливается в оптическом блоке.

Электрическая схема гемоглобинометра состоит из трех блоков: 1) питания; 2) измерения; 3) слива.

Блок питания выдает напряжение, необходимоедля нормальной работы блоков измерения и слива. Стабилизация напряжения питания лампы осуществляется транзисторной компенсационной сетью с усилителем постоянного тока. В качестве фотоэлектрического преобразователя используется вентильный кремниевый фотоэлемент.

Блок измерения устроен по схеме компенсационного измерителя фототока. Фототок, возникающий в цепи фотопреобразователя, подается на микроамперметр. Однако в цепи фотопреобразователя существует некоторое внутреннее шунтирующее сопротивление, поэтому не весь фототок пройдет через микроамперметр (не весь будет зарегистрирован по отклонению стрелки амперметра). В схеме компенсационного измерителя встречно фототоку подается компенсационный ток от постороннего источника через прецизионный (высокоточный) потенциометр. В момент компенсации токов (когда микроамперметр показывает нуль) величина тока компенсации равна величине фототока. Угол поворота движка потенциометра прямо пропорциональна измеряемому току. Движок потенциометра механически связан со шкалой Д. Прибор настраивается таким образом, что максимальный фототок (когда измеряемая жидкость совершенно прозрачна) соответствовал максимальному значению тока компенсации, т.е. шкала Д установлена у отметки 0. Параллельно микроамперметру включено сопротивление, являющееся шунтом. В момент уравновешивания токов, когда их разность не превышает 5 мкА, шунт отключают, нажав кнопку «Измерение» и производят точную компенсацию фототоков.

Таким образом микроамперметр в схеме выполняет роль индикатора тока, что увеличивает точность измерений.

Лабораторная работа .