Аффинная хроматография.

Интересным хроматографическим методом является аффинная хроматография, основанная на нативной специфичности некоторых биополимеров, особенно если они содержатся в культуральной жидкости в небольших концентрациях — менее 1 мкг/мл. В этом методе хорошее разделение достигается за счет специфического взаимодействия между иммобилизованным агентом и растворенным веществом.

Между аффинной хроматографией и другими более традиционными методами адсорбционной или ионообменной хроматографии существуют значительные различия. В традиционных хроматографических методах сначала адсорбируются все компоненты смеси, а их разделение осуществляется на стадии десорбции посредством, например, замены концентрации элюента, или концентрации солей в элюенте, или постепенном повышения рН элюента. Напротив, специфичность аффинной хроматографии определяется в основном на стадии сорбции (рис. 8.3). Поэтому в аффинной хроматографии через колонки целесообразно пропускать раствор разделяемой смеси в течении достаточно длительного промежутка времени, пока не будет достигнуто насыщение неподвижной фазы, так как в нее адсорбируются практически только выделяемые соединение Таким образом, проведение разделения БАВ в аффинной хроматографии приближается к обычной сорбции в неподвижно слое вплоть до насыщения слоя адсорбента и резко отличается о обычного разделения многокомпонентной смеси, вводимой колонку однократно в виде концентрированного раствора.

В этом методе хорошее разделение достигается за счет специфического взаимодействия между иммобилизованным агентом и растворенным веществом. Показаны три стадии: ввод смеси веществ а, разделение б; элюирование, связанное с неподвижной фазой компонента смеси.

Сорбенты для аффинной хроматографии.

Сорбентами для аффинной хроматографии в основном являются полимеры, используемые для гельпроникающей хроматографии, после целенаправленной модификации (агарозы, полиакриламиды, целлюлозы, пористые стекла).

Важнейший параметр при модификации исходных матриц — объемная концентрация, соответствующая группировке, которая, как правило, выбирается эмпирически. Второй важнейший параметр — стабильность нанесенного аффината в процессе сорбции — элюации. Если аффинатами являются белки, например, поликональные или моноклональные антитела, белковые и пептидные ингибиторы, то стабильность слоя аффината можно повысить, проводя дополнительную межмолекулярную сшивку, концентрацию сливающего агента (например, глутарового альдегида) следует выбирать с учетом необходимости избежать существенного изменения конформации сшитых белков, часто приводящей к потере аффината.

При выборе исходного сорбента приходится уделять внимание сокращению размеров доступных областей в порах после введения в них протяженных аффинатов. Поэтому матрицы для биоспецифической хроматографии с объемными аффинатами должны иметь диаметры пор, превышающие в 3—5 раз сумму хроматографических диаметров макромолекул комплексов антиген—антитело, белок—ингибитор и т. д.

При использовании белков в качестве аффинатов следует учитывать гетерогенность сорбционных центров, обусловленную такими факторами, как гетерогенность белков до присоединения (воздействие протеаз и денатурации, изменение структуры и свойств аффинатов в процессе присоединения), а также в процессе разделения. Этот фактор оказывается особенно существенным с точки зрения влияния нагрузки на колонку как при сорбции, так и при выборе условий десорбции.