Определение белка по методу Лоури

Метод предназначен для определения белка в растворах. При этом методе не требуется предварительной минерализации исследуемого материала.

Метод основан на образовании окрашенных продуктов при взаимодействии реактива Фолина с щелочными растворами белков. Интенсивность окрашивания в основном зависит от аминокислотного состава белка(от содержания в исследуемых белках тирозина и триптофана) и измеряется на спектрофотометре при длине волны 750 нм.

Определение белка с биуретовым реактивом

Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса в результате взаимодействия пептидных связей белков с ионами двухвалентной меди в щелочной среде.

Определение белка по адсорбции красителя

Метод основан на измерении интенсивности окраски раствора после адсорбции белками части красителя и их осаждения в присутствии лимонной кислоты. С помощью данного метода можно быстро определить содержание белка в растворе при достаточно хорошей воспроизводимости результатов и высоком коэффициенте корреляции с методом Кьельдаля.

Определение содержание общего и остаточного азота методом Къельдаля

Содержание белковых веществ в продукте определяют по количеству белкового азота, который находят по разнице между количеством общего и небелкового азота с учетом коэффициента пересчета азота на белок.

Содержание азота для многих белков близко к 16%, поэтому количество белковых веществ вычисляют, умножая полученное количество азота на коэффициент 6, 25.

Для определения содержания массовой доли белков соединительной ткани пользуются коэффициентом 5,62, принимая во внимание, что содержание азота в коллагене 17,8%, белков молока и молочных продуктов – коэффициентом 6,37, белков сои – 6,25

Метод определения азота основан на минерализации органических соединений с последующим определением азота по количеству образовавшегося аммиака.

Минерализация проводится нагреванием навески с концентрированной серной кислотой в присутствии катализатора (ртутно-кадмиевая соль или сульфатная смесь, или перекись водорода). Выделившийся аммиак вступает в реакцию с избытком концентрированной серной кислоты и с образованием сульфата аммония. (Рис.3)

Для выделения аммиака сульфат аммония разлагают концентрированным гидроксидом натрия. Выделившийся аммиак поглощается титрованными растворами серной кислоты. Избыток серной кислоты оттитровывают гидроксидом натрия и по количеству связанной кислоты вычисляют количество поглощенного аммиака или соответствующее ему количество азота.

Порядок выполнения работы:

1.Отбор навески ( 0,5-1,0 г);

2.Помещение навески на беззольный фильтр;

3.Помещение навески с фильтром в колбу Кьельдаля (100-150т мл);

4.Добавление концентрированной серной кислоты (10-15 мл);

5.Проведение минерализации с различными катализаторами;

6.Минерализации (50-60 мин до 5-6 часов.);

7.Охлаждение колбы и перенос ее содержимого в мерную колбу 100-200 мл (исходя из массы навески);

8.Доведение объема колбы дистиллированной водой до метки и перемешивание;

9.Отгонка аммиака в приборе;

10.Подготавка прибора;

11.Внесение в отгонную колбу через воронку 25 мл разбавленного минерализата (или количественно переносят содержимое колбы- минерализат);

12.Введение избыточного количества 40%-ного раствора гидроксида натрия

( не менее 3,5 мл раствора NaOH на 1 мл H₂ SO₄ );

13.Пропускание пара в отгонную колбу.

Аммиак отгоняется до тех пор, пока объем жидкости в приемной колбе не увеличивается в 2-3 раза.

Полноту отгонку проверяют по красной лакмусовой бумажке.

Избыток кислоты в приемной колбе оттитровывают 0,1 М раствором гидроксида натрия в присутствии 1-2 капель индикатора Таширо до зеленой окраски.

Количество общего азота рассчитывается по формулу:

Х = 0,0014(V–V₁ ) К V₂ х 100/ (m₀ V₃).

Где:

Х- количество общего азота, %;

0,0014 – количество азота, эквивалентное 1 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование избыточного количества кислоты, мл;

К - коэффициент пересчета на точно 0,1 М раствор гидрлксида натрия;

V₂ - объем минерализата после разведения, мл;

m₀ - масса навески, кг_;

V₃ - объем минерализата, взятый для отгонки аммиака, мл.

При отгонке всего объема минерализата количество общего азота рассчитывают по формуле:

Х = 0,0014(V - V₁ ) К х 100/ m₀

При определении общего химического состава из одной навески

исследуемой пробы содержание белка определяют расчетным путем (по разности) по формуле:

Х = 100 – (х₁ + х₂ + х₃ ),

Где:

Х- содержание массовой доли белка, %

х_{1 –} содержание массовой доли влаги, %;

х₂ – содержание массовой доли жира, %;

х₃ – содержание массовой доли минеральных веществ, %.

Предлагаемый метод позволяет за непродолжительное время (2-2,5ч) при достаточной точности и хорошей воспроизводимости получить данные о содержании влаги, жира, золы и белка, применяя ускоренные операции по обезвоживанию, обезжириваию и озолению одной и той же пробы.

Метод Кьельдаля по определению белка в пищевых продуктах является классическим и широко известен в мировой практике (ГОСТ 25011-81), однако он является трудоемким и продолжительным. В связи с этим используются различные полуавтоматические и полностью автоматические приборы для определения белка Кьельтек. Это такие приборы, как Кьельтек 2100, 2200, 2400/2460 Дании , Kjeltec System 1002 фиры Гекатор» (Швеция) и др., которые позволяют получить более точные результаты при значительном сокращении продолжительности, снижении трудоемкости и уменьшении загрязненности окружающей среды.

ПРИБОР Кьельтек 2100 представляет собой наиболее простую и надежную модель для полуавтоматической дистилляции по Къельдалю. Функции прибора:

• Автоматическая подача щелочи

• Установка времени дистилляции

• Автоматический парогенератор

ПРИБОР Кьельтек 2300 представляет собой полностью автоматический прибор для анализа азота по Къельдалю. Содержит встроенную колориметрическую систему титрования. Результат анализа отображается на дисплее. Функции прибора:

• Автоматическая подача щелочи, приемного раствора и воды в пробирку с образцом

• Автоматический парогенератор

• Автоматическое опорожнение пробирки после проведения анализа

• Несколько программируемых режимов работы

• Встроенный автоматический титратор

ПРИБОР Кьельтек 2400/2460 представляет собой полностью автоматический прибор для анализа азота по Къельдалю с возможностью анализа партий до 60 образцов без участия оператора. Функции прибора такие же как у Къельтек 2300 с дополнительной комплектацией системой подачи образцов с непрерывным их анализом.

ПРИБОР Кьельте к «Гекатор» (Швеция) представлен на Рис. 4,5

Рис. 4 Дистилляционный блок

Рис.5 Устройство Digestor DS-6 для минирализации\сжигания и колба для

титрования