4. Эксайтотоксические механизмы нейротрофических прцессов.

Нарушение функции глиальных элементов при болезнях настроения в лимбических структурах мозга создают предпосылки для развития гиперглутаматергического состояния в указанных структурах. В первую очередь это касается нарушения деятельности глиальных транслоказ глутамата, в частности GLT-1, в результате чего замедляется скорость удаления медиатора из глутаматергических синапсов и концентрация глутамата во внеклеточных пространствах мозга достигает токсического уровня [69]. С другой стороны, в связи с дисфункцией глиальных элементов в структурах переднего мозга уменьшается продукция ко-агониста НМДА рецепторов – D-серина [70]. Поскольку НМДА рецепторы субъединичной композиции NR1/NR2A обладают более низким сродством к глицину и D-серину по сравнению с рецепторами состоящими из NR1/NR2B субъединиц [71], Создается предпосылка для избыточной активации НМДА рецепторов последнего типа. Косвенным подтверждением избыточной активации НМДА рецепторов является выявленная в посмертных исследованиях мозга жертв суицида даун-регуляция глицин-связывающих сайтов НМДА рецепторов во фронтальной коре [72].

НМДА рецепторы субъединичной конфигурации NR1/NR2A и NR1/NR2B в центральных нейронах запускают разные транскрипционные процессы [73; 74]; в частности содержащие NR2A субъединицу НМДА рецепторы активируют рилизинг фактор гуаниновых нуклеотидов Rаs-GRF1, а НМДА рецепторы субъединичной композиции NR1/NR2В активируют Rаs-GRF2. Помимо того, что эти два подтипа НМДА рецепторов участвуют в различных формах синаптической пластичности, они по-разному влияют на процессы выживания и гибели нейронов. В исследованиях на культивируемых нейронах гиппокампа было установлено, что селективная активация имеющих синаптическую локализацию НМДА рецепторов способствует выживанию нейронов, в то время как активация внесинаптических НМДА рецепторов индуцирует апоптотическую гибель нейронов [75]. В постсинаптических уплотнениях нейронов преобладают НМДА рецепторы NR1/NR2A, а экстрасинаптические НМДА рецепторы представлены обоими подтипами НМДА рецепторов, но доминирует популяция NR1/NR2В [76]. В исследованиях на культивируемых срезах коры показано, что относительно селективный блокатор НМДА рецепторов субъединичной композиции NR1/NR2A NVP-AAMO77 усиливает апоптоз нейронов вызванный воздействием НМДА, стауроспорином (угнетающим активность протеинкиназы С) и процедурой депривации кислорода и глюкозы; в то же время селективный блокатор содержащих NR2A субъединицу НМДА рецепторов Ro25-6981 в этих же условиях оказывает выраженное нейропротективное действие. Более того, в исследованиях in vivo показано, что в условиях фокальной церебральной ишемии у крыс NVP-AAM077 увеличивал объем инфаркта, в то время как Ro25-6981 самостоятельно, но особенно в комбинации с высокими дозами глицина существенно уменьшал объем ишемического повреждения мозга [77]. Информация о нейропротективных свойствах активации синаптических НМДА рецепторов, содержащих NR2A субъединицу, и блокады НМДА рецепторов субъединичной композиции NR1/NR2В подтверждены и в других исследованиях [78; 79].

Результаты этих исследований указывают на то, что выделяющийся из пресинаптических терминалей спонтанно или потенциалами действия глутамат в нормальных условиях активирует содержащие NR2A субъединицу НМДА рецепторы и поддерживает нормальную жизнедеятельность нейронов и может противодействовать апоптотическим процессам, не связанным с активацией НМДА рецепторов. В то же время, при некоторых патологических условиях происходит повышение внеклеточного уровня глутамата, который активирует внесинаптические НМДА-рецепторы, содержащие NR2В субъединицу и это индуцирует апоптическую гибель нейронов.

Но, наряду с этим, получены экспериментальные факты, которые противоречат этой довольно привлекательной гипотезе. В исследованиях на зрелых культурах кортикальных нейронов установлено, что длительное присутствие (24 часа) в среде обитания нейронов нейротрофинов (BDNF, нейротрофина 4/5), являющихся лигандами рецепторной тирозинкиназы В (Trk B), вызывают некротическую гибель культивируемых нейронов [80; 81]. Этот факт интересен сам по себе, поскольку в наших представлениях четко устоялось мнение о том, что нейротрофины являются нейропротективными веществами, но главное заключается в том, что вызываемая нейротрофинами гибель нейронов опосредована НМДА рецепторами, имеющими в своем составе NR2A субъединицу. Действительно, воздействие на культуру кортикальных нейронов нейротрофина 4/5 в течение 48 часов вызывает гибель ~80% нейронов, которая ослаблялась неселективным блокатором НМДА рецепторов МК-801; в иммуногистохимических исследованиях установлено, что воздействие нейротрофина сопровождается усилением экспрессии NR2A субъединицы, повышением уровня тирозинкиназного фосфорилирования NR2A и NR2В субъединиц НМДА рецепторов и ростом продукции и внеклеточного уровня коагонистов НМДА рецепторов D-серина и глицина [82]. Таким образом, длительное (тоническое) повышение уровня нейротрофинов индуцирует опосредуемую НМДА рецепторами, содержащими NR2A субъединицу, эксайтотоксическую гибель нейронов.

Механизмы НМДА-зависимой эксайтотоксичности изучены достаточно хорошо. Активация нейрональных НМДА рецепторов вызывает как некротическую, так и апоптотическую гибель нейронов. Некротическую гибель нейронов обычно определяют измерением уровня лактатдегидрогеназы во внеклеточной жидкости – маркера нарушения целостности цитоплазматических мембран, либо окрашивают поврежденные нейроны трипановым синим или пропидиумом йодидом. Апоптоз нейронов определяется микроскопической визуализацией конденсации/фрагментации ядер, либо окраской ядер красителем Hoechst-33342, либо квантификацией ДНК с помощью метода EL ISA [83]. Индуцируемый воздействием НМДА некроз или апоптоз нейронов определяется обычно через 20-24 часа после воздействия эксайтотоксина.

Вызываемая активацией НМДА рецепторов эксайтотоксичность является фрагментом ишемических, травматических и иммунных повреждений мозга [84; 79; 85]. Поскольку ионные каналы НМДА рецепторов, содержащих NR2В субъединицу высокопроницаемы для Ca²+ , активация этих рецепторов сопровождается повышением внутринейрональной концентрации Ca²+ [86; 87]. Ca²+ активирует кальпаины – нейтральные протеазы, которые определяют эксайтотоксическую гибель нейронов и вовлечены в развитие некоторых нейродегенеративных заболеваний [88; 89]. Одним из субстратов кальпаинов является белок цитоскелета спектрин, который разрушается кальпаином [90]. Белок постсинаптического уплотнения PSD-95, который фиксирует С-терминальный домен НМДА рецепторов, также является мишенью действия кальпаинов [91]. Повышение активности кальпаинов вызывает повреждение протеинкиназы С и это способствует активации механизмов апоптоза нейронов. Косвенным подтверждением этого является то, что воздействие ингибиторов ПКС вызывает апоптотическую гибель нейронов [76]. Наконец, повышение внутринейрональной концентрации Ca²+ нарушает работу Ca²+ /Na+ обменника в митохондриях и нарушает их работу [92; 93].

Что касается апоптотического действия активированных НМДА рецепторов субъединичной композиции NR1/NR2А, то они окончательно не выяснены. Имеются данные, что процессы трансдукции индуцируемые активацией данного типа НМДА рецепторов включают повышение активности серин/треониновой фосфатидилинозитол-3- киназы, которая угнетает механизмы апоптоза [94; 95]. С другой стороны, имеются данные, что НМДА рецепторы субъединичной композиции NR1/NR2А способствуют фосфорилированию и повышению активности цАМФ-элементсвязывающего белка (CREB); этот транскрипционный белок усиливает экспрессию нейротрофинов, в частности, нейротрофического фактора мозга (BDNF), который обладает выраженным нейропротективным действием [96; 97].