1.5 Идентификация белков – метод pmf

По значению молекулярной массы невозможно идентифицировать белок. Для идентификации белки, содержащиеся в образце, подвергают ферментативному гидролизу. В качестве фермента чаще всего используют трипсин, но также возможно применение и других ферментов, например пепсина, химотрипсина, эластазы и др. В зависимости от молекулярной массы белка и содержания в нем аминокислот, по которым проходит гидролиз, в образце может содержаться от 10 до 100 и более пептидов. Для каждого из белков набор пептидов, полученных в результате ферментативного гидролиза уникален, соответственно, набор молекулярных масс пептидов гидролизата является характеристичным параметром для идентификации белка. На этом основывается стандартная методика для идентификации белков средствами масс-спектрометрии - методика peptide mass fingerprinting (PMF). Наиболее популярен гидролиз в присутствии трипсина, разрывающий пептидные связи после аминокислот лизин (К) или аргинин (R) и переводящий белки в хорошо предсказуемые фрагменты — триптические пептиды. Для каждого белка с известной последовательностью рассчитывают массы пептидов – продуктов теоретического трипсинолиза – с учетом указанного пользователем числа пропущенных сайтов гидролиза и возможных модификаций. Далее, фактический масс-спектр продуктов гидролиза определяемого белка сравнивают со всеми теоретическими спектрами белков, и выявляется белок, у которого степень соответствия наивысшая. Процедура расчета степени соответствия должна учитывать такие априорные данные как число обнаруженных в масс-спектре пептидов, точность определения масс пептидов, массу белка и т. д.

Для решения этой задачи разработан ряд систем программного обеспечения, таких как Mascot, Sequest, X!Tandem и многие другие. Задача поисковых систем - соотнести полученные масс-спектры с белковыми последовательностями по некоторому алгоритму и оценить степень соответствия экспериментальных и рассчитанных спектров. Главный недостаток метода PMF – это невозможность идентификации белка в смеси. Попытки адаптировать метод PMF для распознавания смеси белков предпринимались неоднократно, однако ни один метод не стал общепринятым.

1.6 Тандемная масс-спектрометрия (мс-мс) и идентификация пептиов по фрагментным масс-спектрам

Тандемная масс-спектрометрия используется для структурного анализа и идентификации веществ в составе смесей. Методика МС-МС состоит из следующих операций [22].

• Разделение в первой МС-ступени первичных, или "родительских", ионов и селекция ионов с единственным значением отношения массы к заряду (m/z).

• Фрагментация этих ионов с образованием разнообразных структурно значимых ионных фрагментов, называемых вторичными, или "дочерними", ионами.

• Масс-анализ дочерних ионов.

Существенно, что, если при использовании метода PMF масс-спектр показывает набор триптических пептидов исследуемого белка, то в случае тандемной масс-спектрометрии каждый отдельный масс-спектр отображает набор фрагментов одного пептида.

В каждый момент времени из всех ионов, образующихся в источнике, для последующей фрагментации отбираются ионы только одного соединения с заданным отношением (m/z). Данные одного МС-МС анализа, как правило, содержат множество фрагментных масс-спектров, каждый из которых содержит фрагменты только одного соединения.

Состав фрагментов отражает структуру анализируемого вещества и напрямую зависит от способа фрагментации. В данное время наиболее часто используют столкновительные ячейки, в которых ионы сталкиваются с нейтральными молекулами газа, что приводит к разрыву ковалентных связей в полипептидной цепи. Для фрагментных ионов пептидов принята классификация, в соответствии с которой фрагменты, содержащие N-концевую аминокислоту, в зависимости от разорванной связи обозначают латинскими буквами a, b и c. Подобно этому, фрагменты C-конца обозначены x, y и z (рисунок 1.6.1).

Рисунок 1.6.1 - Образование основных фрагментов.

Однако, несмотря на то, что масс-спектр содержит множество сигналов, помимо основных предполагаемых, в спектре, как правило, доминируют b и y ионы. После фрагментации достаточного количества родительских ионов, накопленные сигналы b и y ионов могут образовывать полные наборы – серии.