3.4.3 Определение влажности коммерческого сорбента и рммс Fe(III)

По методике, описанной в п.2.2.3.2, определили массу влажного сорбента (55г) и высушенного (21г) и нашли влажность РММС Fe(III), равную 65% (масс. доли).

По методике, описанной в п. 2.2.3.3, определили количество сорбента в 100мкл коммерческого геля – 34,5мг.

3.5 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы

Выделение суммарного белка и гидролиз проводили по методике, описанной в п. 2.2.4 без модификации йодацетомидом.

3.5.1 Приготовление микроколонки с сорбентом

В качестве микроколонки использовали пластиковый наконечник на 300мкл для автоматической пипетки. С помощью длинной иглы (тонкой спицы) в наконечник вкладывали синтетический фильтр. На фильтр помещали подсушенный сорбент, стараясь не оставлять частицы монослоев на стенках наконечника, в таком количестве, что бы слой имел высоту 2-3мм. Затем вкладывали второй синтетический фильтр и уплотняли. Степень уплотнения контролировали продавливанием через наконечник 0,1% раствора TFA – должен продавливаться с небольшим усилием. Сорбент, в полученной микроколонке хранили в 0,1% растворе TFA для предотвращения его пересыхания.

3.5.2 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте

В качестве колонок были использованы фильтры с мембраной Millex-LH. 100 мкл раствора сорбента было помещено на фильтр и промыто 100 мкл 0.1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) и отцентрифугировано 30 секунд при 5000 об/мин. Процедура была повторена трижды. Образец (15 мкл триптического гидролизата) был растворен в 35 мкл 0.1% ТФУ и нанесен на сорбент. Фильтр был помещен в микропробирку и инкубировался в течение 15 минут на качающейся платформе, после чего путем центрифугирования (30 секунд при 3000 об/мин) проскок был удален с фильтра в микропробирку. Чтобы избежать неспецифичной сорбции, сорбент трижды промыли 100 мкл 0.1% ТФУ и центрифугировали 30 секунд при 5000 об/мин. Затем сорбент промыли 100 мкл воды. Для ступенчатого элюирования на фильтр, помещенный в новую микропробирку, было нанесено 30 мкл первого элюирующего раствора (0.1 М аммонийбикарбонатный буфер) и смесь инкубировали в течение 5 минут на качающейся платформе, после чего центрифугировали 30 секунд при 5000 об/мин. Процедура элюирования была повторена дважды. Затем на фильтр было нанесено 30 мкл второго элюирующего раствора (400 мМ гидрооксид аммония) и смесь инкубировали в течение 5 минут на качающейся платформе, после чего центрифугировали 30 секунд при 5000 об/мин. Процедура элюирования была повторена дважды, элюат отбирали для анализа.

3.5.3 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)

Для проведения хроматографии использовали микроколонку, которую при помощи шприца освободили от консервирующего раствора 0,1% ТФУ. Образец (15 мкл триптического гидролизата) нанесли на колонку, помещенную в микропробирку для сбора, и с помощью шприца медленно продавили через сорбент. Проскок сохранили для дальнейшего анализа. Чтобы избежать неспецифичной сорбции, сорбент трижды промыли 15 мкл 0,1% ТФУ, проскок сохранили. Для элюирования, на колонку, помещенную в новую микропробирку, было нанесено 15 мкл 5%-го раствора аммиака. Процедура элюирования была повторена дважды, элюат отбирали для масс-спектрометрического анализа и высушивали.