4. Механізм дії амілолітичних ферментів

Субстратами для дії амілаз є крохмаль, що складається з амілози і амілопектину, і глікоген.

Крохмаль – рослинній полісахарид з дуже складною будовою. Містить 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю.

При вивченні механізму дії амілолітичних ферментів є певні складності, і перш за все вони полягають у тому, що субстрат - крохмаль - неоднорідний і має різні характеристики за ступенем полімеризації глікозидного ланцюга і кількості розгалужень.

Реакції, що каталізується амілазами, мають дві стадії: коротку передстаціонарну і тривалу стаціонарну. Під час першої стадії ендоамілаза швидко зменшує молекулярну масу субстрату, утворюючи суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи. Тому кінцеві продукти гідролізу а-амілазами можуть бути різними. Перша стадія впливу ферменту на субстрат хоча і носить неупорядкований характер, має для всіх видів амілаз схожий механізм.

Існує дві гіпотези про механізм дії екзоамілаз на субстрат. Перша гіпотеза припускає, що, впливаючи на субстрат по одноланцюжкові або «молніеобразному» механізму, екзоамілаза утворює фермент-субстратний комплекс із захопленням нередукуючого кінця ланцюга.

Подальше просування ферменту з цього ланцюга відбувається до повного її гідролізу. За другою гіпотезою (б- і глюкоамілаза діють на субстрат шляхом механізму множинної атаки, тобто фермент утворює комплекс з молекулою субстрату, потім через кілька етапів цей комплекс розпадається і фермент зв'язується з новою молекулою субстрату. Іншими словами, при множинної атаці відбувається щось середнє між неврегульованим механізмом і одноланцюжкові, «молніеобразной» атакою. Для повного гідролізу з цього механізму одна молекула субстрату повинна утворювати багато разів фермент-субстратні комплекси. При цьому можливий гідроліз декількох зв'язків в одному каталітичному акті.

Механізм впливу амілаз на субстрат може бути розглянуто з не-скількох позицій:

1) вид що розривається зв'язку (б -1,4 або б-1,6);

2) тип впливу на субстрат (ендо- або екзо-);

3) вплив на швидкість гідролізу ступеня полімеризації субстрату;

4) можливість гідролізу олігоcахаридів;

5) здатність ферменту до множинної атаці субстрату.

Наявність ознак амілаз, відображених в 3 і 4 позиції, при дії на лінійні субстрати може свідчити про існування у цих ферментів подцентровой структури. Ймовірно, активний центр амілази може складатися з декількох підцентру, кожен з яких може вступати в контакти з глюкозних залишком. Енергія взаємодії (А;), виражена в одиницях вільної енергії (кДж / моль), визначає подцентровое спорідненість ферменту до субстрату. Це спорідненість індивідуально і може бути як позитивним, так і негативним. Ймовірність існування підцентрових структур амілаз допомагає встановити будову активного центру амілаз, дає чітке пояснення субстратної специфічності, але не дає пояснень механізму гідролізу розгалужений субстратів.