Упражнение 1. Изучение гемолиза с помощью колориметра.

Принцип метода. При изучении эритроцитов (гемолиза) уменьшается мутность суспензии, а следовательно, увеличивается светопропускание: раствор становится более прозрачным. В связи с этим изменение пропускания суспензии эритроцитов может служить контролем гемолиза.

Приборы и реактивы: фотоколориметр, установка для облучения эритроцитов, кварцевые пробирки, пипетки.

Пропускание эритроцитов можно определить на фотоэлектроколориметре. Чтобы поглощение гемоглобина не препятствовало измерению светорассеяния, проводят гемолиз с красным светофильтром (670 нм), т.е. в спектральной области, где гемоглобин не поглощается и светопропускание зависит исключительно от мутности (светорассеяния).

Ход работы: Для работы приготавливают 1% суспензию отмытых эритроцитов крысы или человека в физиологическом растворе. Затем из нее готовят 2 разведения в 100 раз: одно – дистиллированной водой, другое – физиологическим раствором. Пропускание обоих растворов измеряют на ФЭК с красным светофильтром. Раствором для сравнения служит дистиллированная вода или физиологический раствор. Через 10, 30 и 60 мин после разведения растворов поводят повторные измерения. Следует убедиться в том, что пропускание суспензии, разведенной водой (гипотонический гемолиз), значительно превышает этот показатель в физиологическом растворе (контроль).

Упражнение 2. Исследование гемолиза эритроцитов под действием освещения в присутствии красителя.

В качестве источника для облучения суспензии эритроцитов используют УФ-лампу. Готовят 1% суспензию эритроцитов в физиологическом растворе, 0,04% раствор эритрозина или метиленовой сини на физиологическом растворе (8 мг эритрозина на 20 мл физиологического раствора). В 2 пробирки наливают по 4,0 мл раствора эритрозина и добавляют в каждую по 1 мл 1% суспензии эритроцитов (пробы 1, 2). В две контрольные пробирки вливают по 4,0 мл физиологического раствора и по 1 мл взвеси эритроцитов (проба 3, 4). После тщательного перемешивания растворов пробы 1 и 3 облучают в кварцевых пробирках в течение 10 мин. Пробы 2 и 4, служащие темновым контролем, в это время должны находиться в темном месте при той же комнатной температуре.

Затем все пробы оставляют в темноте и их пропускание измеряют через каждые 15 мин в течение часа. Определение осуществляют так же, как в упражнении 1. раствором сравнения обычно служит 0,04% раствор эритрозина на физиологическом растворе. Можно использовать также дистиллированную воду. Результаты измерений следует представить в виде графика зависимости пропускания Т от времени после облучения для всех четырех проб:

Эритроциты + краситель + освещение;

Эритроциты + краситель без освещения;

Эритроциты + освещение без красителя;

Эритроциты без красителя и освещения.

Упражнение 3. Исследование зависимости гемолиза от времени освещения.

При многих простых фотохимических процессах число прореагировавших молекул (n) пропорционально дозе, т.е. интенсивности света (I) и времени облучения (t):

.

При постоянной интенсивности действие света пропорционально времени облучения. В биологических системах фотохимические процессы зависят от времени и интенсивности облучения.

Приготавливают 5 кварцевых пробирок, содержащих по 4,0 мл 0,01% суспензии эритроцитов или 0,04% раствора эритрозина в физиологическом растворе (см. упражнение 2). В другие 4 пробирки помещают по 4,0 мл 0,01% суспензии эрироцитов (без красителя). Облучают пробы так же, как и в предыдущем упражнении. Время облучения должно быть различным для каждой пары пробирок (с красителем и без него): 10, 20 и 30 мин.

Определение гемолиза в пробах (см. упражнение 1) осуществляют примерно через час после облучения; это время необходимо для развития полного гемолиза в поврежденных эритроцитах. Более точно момент измерения находят на основании результатов предыдущего опыта. Опыт следует выполнять тогда, когда гемолиз в пробе, облученной в течение 10 мин, достигает 80 – 90% максимальной величины. Результаты представляют в виде графика зависимости пропускания (Т) от времени облучения, на который наносят кривую для контрольных проб (эритроциты без красителя).