1. Биофизика

________________________________________________________________

Лабораторная работа № 1 изучение энергии активации биологических процессов на примере работы na, к-атф-азы

Живой организм представляет собой открытую систему, которая постоянно обменивается с окружающей средой веществом и энергией. Вещества, попадающие в организм извне, вступают в сложный процесс физико-химических превращений. Скорость их в отдельных органоидах, клетках и в целом организме играет решающую роль в регулировании жизненного процесса. В связи с этим важное значение приобретает изучение закономерностей протекания в организме химических реакций.

Биологическая кинетика изучает скорость биологических процессов и ее зависимость от концентрации веществ, участвующих в биологических превращениях, а также от внешних условий, в частности от температуры. Такая зависимость понятна, если учесть, что любое химическое превращение происходит при условии соударения молекул, находящихся в беспорядочном тепловом движении. По мере повышения температуры увеличивается длина пробега молекул и, следовательно, вероятность их столкновения друг с другом. Таким образом, относительное количество молекул с повышением температуры увеличивается, как и скорость реакции.

Величину, показывающую, во сколько раз возрастает количество активных молекул (а следовательно, и скорость реакции) при повышении температуры на 10 °С, называют температурным коэффициентом и обозначают символом Q₁₀ (коэффициент Вант-Гоффа).

Между величиной температурного коэффициента реакции Q₁₀ и той избыточной энергией, которой должны обладать молекулы, чтобы их соударение привело к химической реакции (как называемой энергией активации Е), существует зависимость, которую выражают формулой

Е=0,46Т₁Т₂lgQ₁₀, (1.1)

где Е – энергия активации, кДж; Т₁ и Т₂ – температуры, выраженные в градусах абсолютной шкалы с разницей в 10 °С (Т₂=Т₁+10); lgQ₁₀ – десятичный логарифм температурного коэффициента (Т °К=t °С+273 °).

Приведенной формулой пользуются для определения энергии активации биологических процессов, в том числе секреции желез, пульсации сократительных вакуолей простейших, сокращения мышц и т.д. Для вычисления энергии активации какого-либо биологического процесса необходимо:

1) определить его скорость при двух температурах – Т₁ и Т₂;

2) найти величину Q₁₀, разделив значение скорости, полученное при Т₂, на число, полученное при Т₁;

3) найти десятичный логарифм Q₁₀ и подставить в формулу (1.1) значение в градусах абсолютной шкалы.

Энергия активации рассчитывается не только для отдельных реакций и процессов, но и для клеточного и органоидного уровня.

Проведем расчет энергии активации мембраносвязанного фермента Na, K-АТФ-азы (молекулярный уровень) при разных температурах.

Влияние температуры на ферментативную активность Na, к-атф-азы

Принцип метода. При работе Na, К-АТФ-азы от молекулы АТФ отщепляется одна молекула неорганического фосфора и остается одна молекула АДФ. По нарастанию неорганического фосфора в инкубационной среде судят об активности АТФ-азы:

АТФ → АДФ + Р_н.

Цель работы: установить зависимость скорости образования неорганического фосфора от температуры. Рассчитать коэффициент Вант-Гоффа и энергию активации.

Приборы

Фотоэлектроколориметр (ФЭК), ультратермостат, аналитические весы, разновесы.

Посуда

Чашки Петри, стеклянные пробирки объемом 10 мл, пипетки на 1 и 2 мл, фарфоровая чашка с пестиком.

Реактивы и материалы

Фильтровальная бумага (синяя лента), 18 мМ раствор АТФ, 6,6% раствор молибденовокислого аммония, 20% ТХУ (трихлоруксусная кислота), 2,5% раствор FeSO₄, 7,5 Н раствор H₂SO₄, 0,05 М трис-HCl с рН 7,5, 18 мМ раствор MgCl₂, 5,4 мМ NaCl, 18 мМ раствор KCl, ножницы.

Ход работы

Перед началом опыта необходимо включить термостат (положение HI), предварительно поставив регулятор контактного термометра на 30 °С. Работу нужно начинать только при достижении в термостате заданной температуры. Опыты состоят из 2 серий:

1) контроль и опыт при температуре инкубации 20 °С (комнатная температура);

2) контроль и опыт при температуре инкубации гомогената 30 °С.

Для определения активности фермента берут 50 мг живой ткани (сердце, почка, нерв, мозг), растирают его в фарфоровой ступке с 3 мл трис-HCl буфера (рН 7,5). Полученный гомогенат доводят трис-HCl до конечного объема – 10 мл. После этого отбирают пипеткой 1 мл полученного гомогената и переносят его в пробирку, добавляют 4 мл инкубационной смеси. Инкубационная смесь состоит из 1 мл 0,05 М трис-HCl, 1 мл 18 мМ раствора MgCl₂, 1 мл 18 мМ раствора KCl, 1 мл 5,4 мМ NaCl, рН полученного раствора – 7,5. Затем пробирки первой серии выдерживают при 20 °С 1 мин. После этого в каждую пробирку добавляют по 1 мл 18 мМ раствора АТФ, в контрольную пробу до добавления АТФ вносят 1 мл 20% раствора ТХУ для инактивации фермента. После 5-минутной инкубации при 20 °С реакцию прекращают добавлением 1 мл 20% раствора ТХУ (в контрольную пробу ТХУ второй раз не добавляют). Для дальнейшего анализа берут в пробирки по 1 мл исследуемого раствора (контрольный и опытный) и добавляют туда же 2 мл 7,5 н H₂SO₄, 2 мл 6,6% молибденовокислого аммония и 2 мл 2,5% раствора FeSO₄ (свежеприготовленного). Аналогичный опыт проводят при температуре

30 °С.

Активность фермента определяют по калибровочной кривой в зависимости от величины оптической плотности КН₂РО₄ и концентрации раствора. Оптическую плотность определяют при длине волны 670 нм (красный светофильтр). Зная оптическую плотность исследуемого раствора, по калибровочной кривой нужно найти концентрацию неорганического фосфора в исследуемых растворах, определить температурный коэффициент Вант-Гоффа и рассчитать энергию активации.

Пример. В ходе опыта установлено, что количество неорганического фосфора, образовавшегося в результате гидролиза АТФ, при 20 °С (Т₁=273+20=293) составило 0,9 мкг, при 30 °С – 1,53 мкг (Т₂=273+30= 303).

На основании полученных данных вычисляем температурный коэффициент:

Q₁₀ = = 1,7.

Подставив в формулу (1.1) значение десятичного логарифма величины Q₁₀, равное 0,23045, и выразив показания температуры в градусах абсолютной шкалы, получим численную величину энергии активации:

Е = 0,46 (273+20) (273+30) 0,23045=9,41 кДж/моль.