Упражнение I. Влияние температуры на ферментативную активность Na-, к-атф-аза.

Принцип метода. При работе Na-, К-АТФ-аза от молекулы АТФ отщепляется одна молекула неорганического фомфора и остается одна молекула АДФ. По нарастанию неорганического фосфора и остается одна молекула АТФ. По нарастанию неорганического фосфора и инкубационной среде судят об активности АТФ-азы:

АТФ → АДФ + Р_н.

Цель работы. Установить зависимость скорости образования неорганического фосфора от температуры. Рассчитать коэффициент Вант-Гоффа и энергию активации.

Приборы:

1. Фотоэлектроколориметр (ФЭК),

2. Ультратермостат,

3. Аналитические весы, разновесы.

Посуда:

1. Чашки Петри

2. Стеклянные пробирки объемом 10 мл

3. Пипетки на 1 и 2 мл

4. фарфоровая чашка с пестиком.

Реактивы и материалы:

1. Фильтровальная бумага (синяя лента),

2. 18 мМ раствор АТФ,

3. 6,6% раствор молибденовокислого аммония,

4. 20% ТХУ (трихлоруксусная кислота),

5. 2,5% раствор FeSO₄,

6. 7,5 Н раствор H₂SO₄,

7. 0,05 М трис-HCl с 7,5,

8. 18 мМ раствор MgCl₂,

9. 5,4 мМ NaCl,

10. 18 мМ раствор KCl,

11. ножницы.

Ход работы:

Перед началом опыта необходимо включить термостат (положение HI), предварительно поставив регулятор контактного термометра на 30⁰С. Работу нужно начинать только при достижении в термостате заданной температуры. Опыты состоят из 2 серий:

1) контроль и опыт при температуре инкубации 20⁰С (комнатная температура);

2) контроль и опыт при температуре инкубации гомогената 30⁰С.

Для определения активности фермента берут 50 мг живой ткани (сердце, почка, нерв, мозг), растирают его в фарфоровой ступке с 3 мл трис-HCl буфера (рН 7,5). Полученный гомогенат доводят трис-HCl до конечного объема – 10 мл. После этого отбирают пипеткой 1 мл полученного гомогената и переносят его в пробирку, добавляют 4 мл инкубационной смеси. Инкубационная смесь состоит из 1 мл 0,05 М трис-HCl, 18 мМ раствор MgCl₂, 1 мл 18 мМ раствор KCl, 1 мл 5,4 мМ NaCl, рН полученного раствора – 7,5. Затем пробирки первой серии выдерживают при 20⁰С 1 мин. После этого в каждую пробирку добавляют по 1 мл 18 мМ раствора АТФ, в контрольную пробу до добавления АТФ вносят 1 мл 20% раствора ТХУ для инактивации фермента. После 5-минутной инкубации при 20⁰С реакцию прекращают добавлением 1 мл 20% раствора ТХУ (в контрольную пробу ТХУ второй раз не добавляют). Для дальнейшего анализа берут в пробирки по 1 мл исследуемого раствора (контрольный и опытный) и добавляют туда же 2 мл 7,5 н H₂SO₄, 2 мл 6,6% молибденовокислого аммония и 2 мл 2,5% раствора FeSO₄ (свежеприготовленного). Аналогичный опыт проводят при температуре 30⁰С.

Активность фермента определяют по калибровочной кривой в зависимости от величины оптической плотности КН₂РО₄ и концентрации раствора. Зная оптическую плотность исследуемого раствора, по калибровочной кривой нужно найти концентрацию неорганического фосфора в исследуемых растворах. Определить температурный коэффициент Вант-Гоффа и рассчитать энергию активации.