Количественное определение лпнп и лпонп, общих липидов в сыворотке крови

Задание 1. Определить содержание ЛПНП и ЛПОНП в сыворотке крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай.

Принцип. Метод базируется на способности гепарина образовывать комплекс с ЛПНП и ЛПОНП сыворотки крови, который под действием кальция хлорида выпадает в осадок. Степень помутнения раствора пропорциональна содержанию этих липопротеинов в сыворотке крови.

Ход работы. В 5 мм кюветы ФЕК наливают по 2 мл раствора 0,025 моль/л кальция хлорида. Устанавливают «нуль» при длине волны 720 нм (красный светофильтр). В одну кювету приливают микропипеткой 0,2 мл сыворотки, несколько раз промывают пипетку. Отмечают начальное значение экстинкции Е₁, затем прибавляют микропипеткой 0,04 мл раствора гепарина, который содержит 1 000 единиц в 1 мл, несколько раз промывают пипетку. Перемешивают содержимое кюветы, через 4 мин (по секундомеру) снова измеряют экстинкцию Е₂. Содержание ЛПНП и ЛПОНП (Х) в г/л в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

Х = (Е₂ – Е₁) × 11,65,

где 11,65 – эмпирический коэффициент пересчета содержания липопротеинов в г/л.

Клинико-диагностическое значение. При ультрацентрифугирова-нии крови выделяются липопротеины разной плотности: высокой (ЛПВП), низкой (ЛПНП), очень низкой (ЛПОНП) и др. Фракции липопротеинов отличаются количеством белка и содержанием в процентах отдельных липидных компонентов. Так, ЛПВП содержат большое количество белка (50-60%), имеют высокую относительную плотность (1,063-1,210), тогда как ЛПНП и ЛПОНП содержат меньше белка, значительное количество липидов - до 95% массы и имеют низкую относительную плотность (1,010-1,063). В норме содержание липопротеинов сыворотки крови составляет 3,6-6,5 г/л. Повышение уровня липопротеинов тесно связано с увеличением количества холестерола в крови; им богаты ЛПНП. Увеличение содержания ЛПНП и ЛПОНП наблюдают при атеросклерозе, сахарном диабете и других заболеваниях.

Задание 2. Определить содержание общих липидов в сыворотке крови.

Принцип. Метод базируется на способности продуктов распада ненасыщенных липидов образовывать с фосфатнованилиновым реактивом окрашенное соединение; интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

Ход работы. В сухую опытную пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и осторожно 2,9 мл концентрированной сульфатной кислоты, а в контрольную – 0,2 мл воды и 5,8 мл концентрированной сульфатной кислоты. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают на кипящую водяную баню на 10 мин (осторожно!). Затем обе пробирки быстро охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуре. Из опытной пробирки отбирают 0,2 мл, а из контрольной – 0,4 мл охлажденной смеси в другие пробирки, в которые заранее наливают фосфатнованилиновый реактив: в опытную – 3 мл, в контрольную – 6 мл. После тщательного перемешивания стеклянной палочкой пробы ставят на 45 мин в темное место при комнатной температуре для развития окраски. Фотометрируют опытную пробу против контрольной на ФЕК при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в 5 мм кювете. Содержание общих липидов (Х) в г/л в сыворотке крови рассчитывают по формуле: Х = (m × 10 000 × 3)/(0,2 × 1 000),

где m – масса общих липидов пробы, найденная по калибровочному графику (мг); 10 000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови; 1 000 – коэффициент пересчета мг в г; 3 – общий объем начальной смеси (мл); 0,2 – объем смеси, взятой для проведения цветной реакции (мл).

Клинико-диагностическое значение. Содержание липидов крови (в частности триглицеридов, фосфолипидов, холестерола) в комплексе с белками (альбуминами) и в форме липопротеинов является важным диагностическим показателем. Нормальное содержание общих липидов в сыворотке крови составляет 4-8 г/л. Повышение содержания липидов в крови (гиперлипидемия) как физиологическое явление происходит через 1-4 ч после употребления богатой липидами пищи. Натощак уровень общих липидов снижается (гиполипидемия). Увеличение концентрации липидов в крови наблюдается при диабете (до 10-20 г/л), циррозе печени, атеросклерозе, ожирении, ишемической болезни сердца, липоидном нефрозе (заболевание почек), остром гепатите, панкреатите у лиц, которые злоупотребляют алкоголем.