Эндотоксины

Эндотоксины - сильно отрицательно заряженные макромолекулы и могут быть адсорбированы на анионообменнике. Как и с НК, альтернативой является адсорбция продукта на катионообменнике, гидрофобном или аффинном сорбенте, что позволяет эндотоксинам проскакивать через колону.

Вирусы

Вирусные частицы достаточно крупные и будут элюированы в мертвом объеме большинства гель-фильтрационых матриксов. Так как поверхностные свойства вирусов значительно различаются, то лучше всего применять комбинации методов для эффективного удаления, основанного на хроматографической адсорбции. Инактивацию вирус в препарате фактора VIII осуществляли, например, обработкой растворителем/детергентом с последующей очисткой на катионообменнике.

Добавки (аддитивы)

Например, фенол красный, содержащийся в культуральной среде, свяжется с анионообменником и изменит емкость сорбента. Использование катионообменника на первом этапе, на котором будет связан продукт, предотвратит такую потерю емкости колоны. Обессаливание можно использовать для удаления добавок с низким молекулярным весом и растворенных малых ионов.

Большие объемы гидрофобных растворов могут быть удалены, например, осаждение сульфатом аммония до хроматографии.

Требования к заключительному процессу производства

Обычные лабораторные методы очистки не могут быть подходящими для крупномасштабного производства. Такой пример был получен в процессе разработки метода для производства векторов на базе плазмидной ДНК для последующего использования в генной терапии. Анализ касался всех добавок с целью гарантировать, что процесс будет соответствующим для производства инъекционных продуктов. Лабораторная схема очистки была найдена недопустимой, т.к. в ней использовались мутагенные реактивы типа бромида этидия, а также и методы центрифугирования, которые трудно было масштабировать. Одного гель-фильтрационного хроматографического этапа было достаточно для того, чтобы заменить добавки мутагенных реактивов и ультрацентрифугирование в крупномасштабном процессе. В другом случае центрифугирование заменили на хроматографию для очистки вирусной вакцины. Вместо использования многократного непрерывного центрифугирования для масштабирования традиционной лабораторной процедуры изопикнического осаждения были использованы два анионобменных хроматографических шага, чтобы очистить инактивированный ВИЧ-1 по значительно более низкой цене.

Таким образом, важность развития схемы очистки для потенциально крупного масштаба очевидна. Рекомендуемый подход состоит в том, чтобы приспособить предварительную процедуру к самому большому масштабу, который является применимым для продукта, а затем понижать масштабы этой процедуры для экспериментальной оптимизации в лабораторном масштабе. Стимулы для экспериментов в лабораторном масштабе включают не только низкую стоимость и получение более быстрых результатов, чем в крупном масштабе, но также факт, что некоторые эксперименты, например валидацию вирусного удаления, невозможно выполнить на крупном масштабе. В таких случаях подходящий «от масштабирования до минимизирования» («scale-up by scale-down») подход является незаменимым для достижения требуемых результатов. «Правила» для линейного масштабирования должны выполняться, чтобы получить предсказуемые результаты. Документ вирусной безопасности Международной конференции гармонизации заявляет, что «Уровень очистки минимизированной версии должен представить настолько близко насколько возможно процедуру производства. Для хроматографического оборудования, свободного объема колоны, времени контакта, типов буфера и сорбента, pH, температуры, концентрации белка, солей и продукта должно все совпадать, чтобы представлять коммерциализованное производство.

Ключевые факторы для успешного крупномасштабного процесса включают ошибкоустойчивость с указанием вариаций в составе РЦП, потоков и подготовке буферов, а также вариации от партии к партии хроматографических сорбентов. Эти факторы должны быть описаны в течение проектирования этапов очистки. Изменение, например, в инкубационной среде содержания сыворотки теленка от 10% до 0% вызывает изменение в чистоте продукта, r-активатора тканевого плазминогена (r-tPA), от 60 до 95% при проведении идентичной процедуры очистки. Необходимо также отметить, что изменения в качестве добавок (например, БСА) для ферментации может влиять на результат очистки. Влияние хроматографических сорбентов может быть проиллюстрировано различными уровнями удаления вирусов сорбентами с различной основой, но с теми же самыми функциональными группами, и вариациями уровня удаления ДНК сорбентами с отличающимися размерами пор.

Процесс может быть разработан пошаговым – прерывистым (например, ферментация и этапы очистки будут выполняться независимо от друг друга), а также непрерывным. Первичные шаги очистки могут быть встроены в этап ферментации путем использования «ЕВА», причем, последние разработки в технологии «ЕВА» позволяют использовать закрытые системы.