Оптимизация этапов очистки Цели оптимизации

Оптимизация этапов очистки включает мероприятия по заказу техники, которая будет использоваться, и оптимизации условий хроматографии для получения продукта достаточной чистоты и соответствия объемов планируемых шагов для полной переработки промежуточных продуктов, полученных на предыдущих шагах. Блоки задания, обычно используемые для хроматографии, основаны на разделении по размеру (GF), заряду (IEC), гидрофобности (HIC), липофильности (RPC) и аффинности (AC). Распределение по частицам увеличивается в следующем порядке GF < IEC, HIC, RPC < AC. AC традиционно редко используется на ранних стадиях схемы очистки, где еще высока возможность загрязнения сорбента, что ведет к укорочению срока службы относительно дорогих аффинных сорбентов, и также вследствие того, что емкость аффинных сорбентов традиционно более низкая чем, например, ионообменных сорбентов. Однако, эта тенденция недавно была нарушена, и с помощью метода StreamLine (EBA) была успешно проведена начальная очистка на сорбенте с иммобилизованным r-белком А.

Чистота

Для достижения высокой чистоты наиболее важен параметр хроматографического сорбента - селективность. Хроматографический сорбент с высокой селективностью используется для достижения высокого разрешения между продуктом и близко элюируемой примесью. Учитывая, что разрешение является одним из фундаментальных показателей степени разделения, значение разрешения для некоторых различных случаев и влияния на чистоту и/или извлечение показано на рисунке 4. Отметим, что чистота 99.9% при извлечении 95% требует разрешения 1.0 между продуктом и примесью, составляющей 10% стартового материала, при условии, что пики симметричные (это редкий случай при высоких нагрузках). Фактор разрешения 1.5 используется как референтный, так как соответствует, практически, полному разделению пиков (то есть чистота 100% при выходе 99% из смеси 50/50), и обеспечивает некоторый запас прочности в случае изменения состава потока и типичного объема. Однако необходимо отметить, что фактор разрешения 1.5 ни в коем случае не является мерилом чистоты - чистота собранной фракции должна быть подтверждена дополнительными исследованиями. Фактор разрешения жестко связан с чистотой, требуемым выходом и типом присутствующих примесей. Цель оптимизации каждого индивидуального шага состоит в том, чтобы достичь достаточного разрешения продукта от примесей при рабочих условиях.

Рисунок 4. Извлечение (выход) как функция чистоты при различных факторах хроматографического разрешения для образца, содержащего 10% примеси.

Стратегия разделения может определяться относительной легкостью достижения высокого разрешения при использовании разных методов, т.е. коэффициент разделения, равный 1.5, не является конечной целью для каждой стадии. Хроматографическое разрешение достигается большим разделением (расстояние между пиками) и низким коэффициентом разброса (ширина пика), как следует из рисунка 5. На величину расстояния между пиками влияет характерная избирательность хроматографического сорбента, наклон градиента и длина колонки. Фактор разброса определяется скоростью потока, размером частиц сорбента, временем удерживания и коэффициентом диффузии растворенных веществ. "Вне-колоночные" факторы (например, большие мертвые объемы, камеры смешивания и т.д.) будут также влиять на расширение пиков.

Рис. 5. Достижение хроматографического разрешения. Разрешение может быть увеличено (а) благодаря достижению большего расстояния между пиками (селективность) и/или (б) снижению ширины пика (эффективность колонки). Степень разделения может снижаться вследствие (в) "вне-колоночных" факторов (например, вследствие большого объема образца). Объемы образцов составляют 0.1 и 10% объема колонки для хроматограмм (б) и (в), соответственно. Рисунки выполнены без соблюдения масштаба.

Извлечение

Извлечение активного продукта является главной целью разделения и зависит от достигаемого разрешения и требования по чистоте. В некоторых случаях материал может быть необратимо потерян на хроматографическом сорбенте или денатурирован, что приводит к низкому извлечению активного продукта, даже если чистота и производительность высокие. Таким образом, контроль выделения при оптимизации является очень важным. Следует также отметить, что потеря активного продукта может быть обусловлена большим временем удерживания в установке или на колонке и, следовательно, этот параметр также должен жестко контролироваться