Хроматографическая система

Схематическое изображение типичных хроматографических систем показано на рисунке 2. Насос используется для проталкивания раствора через колону, которая упакована хроматографическим сорбентом, со скоростью потока F (литры в час), создавая давление во всей колоне Δр (мега Паскаль - МРа). После эквилибрации хроматографического сорбента (например, буфером с низкой ионной силой для lEC) образец (РЦП) наносится на колону стандартным насосом в готовности взаимодействовать с хроматографическим сорбентом. Затем начинается подача элюирующего буфера и компоненты разделяются в порядке увеличивающегося сродства к хроматографической среде (уменьшение размер при гель-фильтрации). В момент вытекания элюента из колоны он проверяется (непосредственно в потоке или автономно) для определения состав потока, целевые фракции собираются и передаются на следующий этап по схеме очистки.

Гипотетическая хроматограмма (т.е. запись самописцем кривой поглощения УФ-датчика детектора) показана на рисунке 3 и иллюстрирует следующие особенности:

• Никакой образец не появится в элюенте, пока один «мертвый» объем колоны не прошел. Этот объем идентичен объему между упакованными частицами сорбента и равен приблизительно 30-45% полного внутреннего объема колоны. Иногда мертвые объемы шлангов трубки и соединений включают в эксплуатационное определение пустого объема.

• В отсутствии взаимодействий сорбента и раствора (например, как в гель-фильтрации) компоненты РЦП (пробы) элюируются в пределах одного объема колонки, в то время как взаимодействие «сорбент-раствор» преднамеренно используются в адсорбционной хроматографии (например, ионообменная хроматография) для задерживания компонентов и их элюции через 4-10 объемов колонки с целью увеличения разделения.

• В случае полного отсутствия взаимодействий сорбента и раствора в гель-фильтрации компоненты РЦП, по молекулярной массе превышающие размеры пор сорбента, элюируются в пределах одного мертвого объема колонки.

Рис. 3. Хроматограмма, иллюстрирующая объема разделения при гель-фильтрации, ограничиваемой 1 объемом колонки, и при адсорбционной хроматографии (например, IEC), типично регулируемой 5-20 объемами колонки.

Разделение может быть в дальнейшем еще увеличено путем удержания целевого продукта на матриксе и последующего отмывания примесей, а целевую молекулу элюируют подвижной фазой со ступенчато или линейно меняющимся составом (например, как в линейном или ступенчатом градиенте элюции, где объем удержания может быть до 20 объемов колоны).

Выбор конфигурации хроматографа должен идеально отражать полную систему производства в условиях диспергирования пробы, времени удержания и относительных объемов для предотвращения воздействия на результат системных параметров при масштабировании. Однако, требования к хроматографам, например, гибкость, степень автоматизации и т.д., могут меняться от задачи к задаче.

Исследование

Автоматизированные, гибкие системы являются наиболее оптимальными как оборудование для разработки процесса. На этой стадии разрабатываются и подбираются наиболее подходящие методы, хроматографические сорбенты и условия (например, pH и ионная сила), а также последовательность шагов в схеме очистки. Гибкость системы требует способности работать с различными химическими веществами, различными размерами частиц и различными размерами колонки. Использование системы, предназначенной для разработки метода, облегчит процедуру оптимизации (Рис. 5.3.). Система должна иметь возможность простого реконфигурирования с учетом оптимизации всех шагов в процессе очистки. Тщательная документация всех параметров требуется для передачи процесса в пилотный масштаб и для создания дальнейших обработок. Система разработки процесса лабораторного масштаба должна гарантировать автоматическую документацию объемов, скорости потока, и сигналов монитора. Программное обеспечение должно также быть гибко и «дружественно» с пользователем для упрощения поиска оптимальных хроматографических сорбентов и условий очистки. Автоматизированная система, которая позволяет оценку больших количеств данных, может определенно ускорять разработку хроматографического процесса.