Метод тандемних повторів

VNTR (variable number tandem repeats) – варіюючі по кількості тандемні повтори – характеризуються вмістом 10-15 нуклеотидних «корових» послідовностей. За допомогою ДНК-зондів, що сконструйовані тандемно повторюваних «корових» послідовностей, можна аналізувати індивідуальну мінливість в одиничних чи то множинних високополіморфних локусах, що мають однотипну «корову» послідовність. Як приклад можна привести VNTR в інтроні міоглобінового гену, що включає в себе чотири тандемні повтори із 33 п.,н., що фланктовані прямими повторами із 9 п.,н. отримані із такого району ДНК-зонди викотистовуються для ідентифікації особистості методом геномної дактилоскопії (фінгерпринтінгу).

За тиким же принципом влаштований STR-аналіз (Short Tandem Repeat), різниця лише в тому що за допомогою STR-аналізу детектується більш ко-ротші повтори – приб-лизно 2-5 п.,н.

Аналіз поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів

(RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism)

Наявність сайтів рестрикції в геномній ДНК та їх взаємне розташування визначається послідовністю нуклеотидів досліджуваної ДНК, оскільки сам сайт рестрикції – не що інше як строго визначена послідовність нуклеотидів ДНК, що узнається та розчеплюється рестриктазами. Відповідно, будь-яка мутація, що змінює послідовність нуклеотидів сайту рестрикції, знищує цей сайт. RFLP-аналіз може бути значно зпрощений в тому випадку, якщо можлива ампліфікація чистини ДНК що містить мутантний сайт. Тестування стану такого локуса можливо шляхом проведення ПЛР та рестрикції ампліфікованого фрагменту. Метод RFLP широко використовується в генетичних дослідженнях популяцій, а також можливе використання в медичній діагностиці, оскільки наявність в геномі доссіджуваного організму рестрикційного фрагменту ДНК певної довжини являється прекрасним генетичним маркером і одночасно фенотипічною ознакою, що тісно повязана з генотипом організма.

TaqMan

TaqMan це синтетично синтезованні лінійні рлігонуклеотиди з комплементарною структурою до частини внутрішньої послідовності аппліфікованого фрагменту, що містять у своїй структурі люмінофор та речовину що його гасить. Полімераза, що добудовує комплементарний ланцюг до одноланцюгової ДНК, розчеплює олігонуклеотид що зустрічається на її хляху, таким чином звільняючи люмінофор від інгібітора, що веде до збільшення люмінісценції в реакційній суміші.

Молекулярні бекони

Молекулярні бекони (Molecular Beacon) це синтетично синтезовані одноланцюгові олігонуклеотиди що мають стержневопетлеву структуру. Петля має комплементарну будову до частини шуканого ампліфікованого фрагменту, а стержень складається з двох плечей петлі, що маютьт комплементарну послідовність один до одного. На одному з плечей міститься флюороформ, а на іншому речовина що гасить його люмінісценцію. Отже в у вільному стані ця структура не люмінісцеює. При гібридизації петлі з комплементарною послідовністю вся структура набуває лінійної конформації, а одже спостерігається люмінісценція.

Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) – метод що дозволяє напрацьовувати кДНК за ізотермічних умов. Суть метода полягає у використанні трьох ферментів що забезпечують безперервний синтез нуклеїнової кислоти. В реакції використовуються ревертаза, РНК-аза Н та ДНК-залежна РНК-полімераза (як приклад T7 RNA polymerase). Ревертаза будує кДНК на шуканій РНК, РНК-аза Н розщеплює в дуплексі ДНК-РНК РНК а Т7 РНК-полімераза синтезує нову РНК з кДНК, що використовується в наступному циклі, таким чином коло замикається.

Нада подивитися в чому різнизя між 3SR та NASBA