Полімеразна ланцюгова реакція

За створення методу ПЛР (PCR, Polymerase Chain Reaction) Керрі Мюллісу в 1993 р було присуджено Нобелівську премію. ПЛР дозволяє знайти в досліджувальному клінічному матеріалі невеликий, декілька десятків пар нуклеотидів ДНК або РНК, будь-якого організму, що міститься в досліджувальному зразку серед великої кількості нуклеотидних послідовностей іншої природи, та швидко розмножити його. По суті ПЛР імітує в пробірці природню реплікацію ДНК, але яка повторюється стільки разів, скільки потрібно досліднику. Для проведення реакції використовують специфічні олігонуклеотидні затравки (праймери) що комплементарно звязуються зі 3¹ кінцем шуканої частини ДНК на різних її ланцюгах та термостабільну полімеразу що має здатність добудовувати комплементарний ланцюг на одноланцюговій ДНК у напрямку з 3¹ до 5¹ кінця починаючи з праймера. Проведення аналізу вимагає використання спеціального обладнання (ампліфікатора) що забезпечує швидку зміну температури реакційної суміші.

Для дослідження РНК-ових обєктів використовують зворотньотранскриптазну ПЛР (Reverse transcription PCR, RT PCR). Суть метода полягає у попередньому синтезі кДНК на молекулі РНК, що далі використовується для проведення ПЛР. Для збільшення чутливості методу використовують гніздову та напівгніздову ПЛР (Nested, heminested PCR) з використанням трьох та чотирьох праймерів, що забезпечує підвищення ефективності аналізу.

Цикли

Олігонуклеотидні прамери

Цикли

Ланцюги днк

Продукти ПЛР

2^n-1 продуктів

На даний час існує декілька розробок для порівняння нативної ДНК, що береться до аналізу це Competitive PCR, конкурентна ПЛР та Comparative PCR, порівняльна ПЛР, що схожі за своєю ідеологією. Ці модифікації дозволяють визначати вірусну нагрузку, що забезпечує коректну постановку діагноза та контроль лікування.

Плр в реальному часі

ПЛР в реальному часі (Real-time PCR) це технологія що дозволяє коректно оцінювати кількість копій ДНК\РНК в зразку що на сьогоднішній день є потужним інструментом оцінки вірусної нагрузки при терапії захворювань на гепатити (HCV, HBV) та HIV, в онкологічній практиці щодо оцінки експресії маркерних РНК при встановленні діагнозу, прогнозу виживання після терапії, оцінки наявності метастазів. ПЛР з флуоресцентними зондами що забезпечують моніторинг в реальному часі за проходженням реакції та накопиченням продукту ПЛР від першого до останнього її кроку. Real-time PCR представлена на сьогоднішній день двома варіантами конструкції флуоресцентних зондів Taqman та Molecular Beacon.

Молекулярні бекони

Молекулярні бекони (Molecular Beacon) це синтетично синтезовані одноланцюгові олігонуклеотиди що мають стержневопетлеву структуру. Петля має комплементарну будову до частини шуканого ампліфікованого фрагменту, а стержень складається з двох плечей петлі, що мають комплементарну послідовність один до одного. На одному з плечей міститься флуорофор, а на іншому молекула що гасить його флуоресценцію. При гібридизації денатурованої петлі з комплементарною послідовністю амплікону вся структура набуває лінійної конформації, а отже спостерігається флуоресценція.

TaqMan

TaqMan це синтетичні лінійні олігонуклеотиди з комплементарною структурою до частини внутрішньої послідовності ампліфікованого фрагменту, що містять у своїй структурі флуорофор та молекулу що його гасить. Полімераза, що добудовує комплементарний ланцюг до одноланцюгової ДНК, розщеплює зонд, що зустрічається на її шляху, таким чином звільняючи флуорофор від молекули-гасника, що приводить до збільшення флуоресценції в реакційній суміші еквівалентно кількості копій вихідної матриці.

Amplified fragment length polymorphism (AFLP) – метод, що широко використовується у генетичних та генно-інженерних наукових дослідженнях. AFLP це по суті удосконалений метод полімеразної ланцюгової реакції (PCR, AFLP-PCR) що технічно застосовується при генетичній дактолоскопії (фінгерпринтінгу), побудові генетичних карт, високо-чутливий метод для дослідження поліморфізму в ДНК. При проведенні AFLP використовують рестриктазу що розщеплює генномну ДНК, потім відбувається лігування дволанцюгового адаптора з утвореними рестрикційними фрагментами. Після такої процедури проводиться ПЛР з використанням двох праймерів що комплементарні адаптору та частині рестрикційногго сайту фрагмента. Після закінчення аналізу набір ампліконів, що утворилися, своїми розмірами відповідають розмірам між рестрикційними сайтами на полінуклеотидному ланцюзі.