Лігазна ланцюгова реакція
При проведені лігазної ланцюгової реакції (ЛЛР, LCR - ligase chain reaction) використовується здатність ДНК-лігази відновлювати фосфодиефірні звязки в одноланцюгових розривах дволанцюгових ДНК. Для проведення реакції потрібно мати ДНК лігазу, специфічні олігонуклеотидні затравки (праймери), буфер для проведення реакції та досліджувану ДНК. Праймери комплементарні одноланцюговій послідовності нуклеотидів ДНК, котрі після гібридизації з такою послідовністю прилягають один до одного, але між ними є “щілина” в один нуклеотид. При цьому 3`-кінець другого олігонуклеотида повинен мати вільну 3`-ОН-групу, а в 5`-положенні 5`-кінця першого олігонуклеотида повинна міститися фосфатна група. Відповідно за схожою схемою повинні бути сконфігуровані два синтетичних олігонуклеотиди що комплементарні до іншого ланцюга ДНК.
В першому циклі ЛЛР ці два праймери звязуються з досліджувальною ДНК в присутності термостабільної ДНК-лігази. Реакційну суміш прогрівають до температури, що оптимальна для роботи ДНК-лігази, після чого між олігонкклеотидами утворюється фосфодиефірний зв'язок. Потім температуру підвищують до температури плавлення гібриду. Цикл повторюють 20-30 разів.
З допомогою цього методу можна виявляти заміну в полінуклеотидному ланцюзі всього в один нуклеотид в мультиплексному варіанті пошуку множинних точкових мутацій в досить великих локусах геному.
Графічне представлення проходження реакції ЛЛР
Графічне представлення не проходження реакції ЛЛР у звязку з мутацією в полінуклеотидному ланцюзі
Хеліказо-залежна ампліфікація
HAD (Helicase-dependet amplification) ампліфіка-ційний ізотермічний метод що дозволяє проводити аналіз за однієї незмінної температури з використанням фермента хелікази, що здатна розплітати подвійний ланцюг ДНК, забезпечуючи, там самим, місце для посадки праймерів та роботи полімерази.
NASBA
Nucleic Acids Sequence Based Amplification – ампліфі-кація, що базується на послідовності нуклеїнової кислоти.
Полінуклеотидний ланцюг (ДНК чи то РНК) може бути ампліфікованим in vitro за ізотермальних умов при використанні трьох ферментів за алгоритмом їх використання ретровірусами: ревертази, РНКази Н та ДНК залежної РНК полімерази. При проведенні 3SR реакції після одно- двогодинної інкубації за сталої температури можна отримати 107 копій шуканого фрагменту РНК.
Реакційна суміш складається з ревертази, РНКази Н, ДНК залежної РНК полімерази, праймера який має у своїй структурі промотор для Т7 (SP6) ДНК залежної РНК полімерази, яка при роботі під своїм промотором синтезує з однієї копії дволанцюгової ДНК декілька сотень копій РНК.
Дуже схожий за своєю ідеологією метод 3SR (Selfsustained sequence replication) самопідтримуюча послідовність реплікації, що, по суті, являється методом TAS, але виникла трохи пізніше, та була запатентована як приватна розробка, для використання в діагностиці. Різниця методів 3SR та NASBA заключається лише в тому що в останньому використовується в праймері промотор для полімерази, що поизводить до значно більшого виходу продукту.
