Ампліфікація з витісненням ланцюга

Р еакція ампліфікація з витісненням ланцюга (SDA, Strand Displacement Amplification) безується на здатності деяких рестриктаз робити одно ланцюговий розрив на дволанцюговій ДНК в модифікованому сайті рестрикції, та ДНК полімерази, як приклад фрагмент Кльонова, екзонуклеазної властивості та здатності добудовувати 3` кінець ланцюга що комплементарний праймеру, цим самим забезпечуючи накопичування шуканого фрагменту.

Loop-Mediated Isothermal Amplification

L

oop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) це якісно новий підход до апліфікації нуклеїнових кислот що дозволяє ампліфікувати ДНК з великою специфічностю, селективністю та досить високою швидкістю при постійній температурі (ізотермальна ампліфікація), що дозволяє використовувати лише термостат. Унікальність методу полягає у використані лише одного ферменту ДНК-полімерази, що має здатність розплітати подвійний ланцюг нуклеїнових кислот, у випадку роботи з ДНК, та двох ферментів ДНК-полімерази і ревертази, у випадку роботи з РНК. При використанні чотирьох праймерів чутливість реакції зростає в три – чотири рази по відношенню до звичайного ПЛР чи то гніздової ПЛР.

Transcriptional based Amplification System (TAS)

Т ранскрипція що базується на ампліфікації цей метод потребує принаймі двічі зміну температути. Для проведення реакії потрібно два фермента – термостабільна ревертаза та ДНК-залежна РНК полімераза, та два праймери: один для ревертази що містить в своєму складі промотор для ролімерази, а другий праймер з аналогічним промотором використовується для ампліфікації ДНК. Якщо ми маємо справу з РНК-овим обєктом то процес буде проходити за наступною схемою:

Якщо ж у нас ДНК-овий обєкт то різниця буде лише в тому, що спочатку ми синтезуємо РНК з ДНК а потім все за вище-наведеною схемою.

Мікроматриці та мікрочіпи

Мікроматриці ДНК використовують для аналізу нуклеотиднтх послідовностей. В основу методу покладенно здатність одноланцюгових нуклеїнових кислот комплементарно звязуватися (гібридизуватися, утворювати гібриди) з ковалентно-зшитими з поверхністю (скло, полімер) одноланцюговими ДНК.

На поверхню скла чи то іншого твердого носія іммобілізують у вигляді правильно розміщених мікроточок (мікрокрапель) фрагменти ДНК(к-ДНК) з відомою послідовністю нуклеотидів (частіше за все синтетичні олігонуклеотиди до 60 нуклеотидів).

При гібридизації в жорстких умовах отриманих мічених сRNA (кодуючих РНК, наприклад) утворюються ДНК-ДНК чи то ДНК-РНК-гібриди, котрі виявляють за появою в данній точці мікроматриці сигналу у вигляді флуоресціюючої точки.

Такі частинки твердого носія з нанесиними мікроматрицями отримали назву мікрочіпів (наночіпів).

Мікрочіпи використовуються при скринінгу геномних бібліотек та в діагностиці. Використання цього методу діагностики в медицині – це якісно новий крок до вирішення проблем правильного лікування генетичних захворювань, тому що лише невелика кількість хвороб виникає врезультаті пошкодження окремих конкретрих генів. В більшості випадків приходиться говорити про спадковий характер захворювання що визване присутністю в геномі конкретної мутації. Співставлення генетичної інформації, що отримана при використанні ДНК-мікрочіпів, з результатами статистичного аналізу виникнення, протікання та наслідку захворування може дати ключ до правильної інтерпритації результатів генетичного скринінгу генома людини.

Здатність одночасного спостереження за змінами експресії дуже великого числа генів в строго контролюємих умовах відкриває нові перспективи функціонального дослідження геному як єдиниого цілого.