14. Характеристика гистонов и протаминов.

Гистоны и протамины это простые белки, они состоят только из аминокислотных остатков. Гистоны и протамины называют ядерными белками.

Гистоны входят в состав нуклеопротеинов. Представляют собой основные белки с молекулярной массой от 12000 до 20000, содержащие в составе молекулы 20-30% аминокислот с положительно заряженными радикалами (обычно аргинин и лизин). Гистоны не содержат триптофана, растворимы в разбавленных кислотах (0,2М HСl ), осаждаются аммиаком и этанолом, имеют изоэлектрическую точку при рН 8,5. Это белки со щелочными свойствами. Гистоны содержатся главным образом в ядрах клеток животных и растений, где играют важную роль в структуре хроматина (нитевидного комплекса ДНК, гистонов и др. белков). Они поддерживают скученность ДНК. И регулируют синтез белков в организме. Гистоны входят в клетки желез внутренней секреции, лейкоциты, эритроциты.

Протамины(простейшие белки). Это относительно небольшие белки с молекулярной массой до 10 000. В составе молекулы этих белков содержится до 85% аминокислот с положительно заряженными радикалами (обычно аргинин) и ограниченный набор (6 - 8) других аминокислот, что обусловливает их основные свойства. Протамины растворимы в слабых растворах кислот, не осаждаются при кипячении, имеют изоэлектричекую точку при рН 10 -12, входят в состав белков нуклеопротеинов, не содержат триптофан и серу. Содержатся в клетках печени, селезенке, почках.

23. Обратимые реакции осаждения белков (высаливание).

Высаливаниемназывается реакция осаждения белков из их растворов солями щелочных металлов NaCl, (NH₄)₂SO₄ и др. Реакция высаливания обусловлена дегидратацией коллоидных частиц белка с одновременной нейтрализацией заряда. При высаливании белок обычно почти не теряет присущих ему физико-химических и биологических свойств. Он вновь растворяется в воде, и обычно при этом не меняются ферментативные, антигенные, иммунные и другие биологические свойства, т. е. остается нативным.  Осаждение белка методом высаливания при различной степени насыщения и различномpHраствора используют для разделения белковых фракций при получении очищенных ферментных и гормональных препаратов, а также для получения белков в кристаллическом состоянии. Более высокомолекулярные глобулины легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины выпадают из раствора при полунасыщении сернокислым аммонием, т.е. при прибавлении к раствору белка равного объема насыщенного раствора соли. Альбумины выпадают из раствора при добавлении кристаллического сернокислого аммония, начиная с 65% насыщения до полного насыщения, т.е. до прекращения растворения соли. При разделении белковых фракций методом высаливания с помощью с помощью других солей например:NaCl,NH₄Cl, Na₂SO₄выделения глобулинов требуется полное насыщение солью, а для выделения альбумина, помимо насыщения, необходимо подкисление раствора уксусной кислотой.

Высаливание белка является процессом обратимым. Убедиться в обратимости высаливания легко. Достаточно уменьшить концентрацию соли в растворе. Этого можно достичь, например, путем диализа или добавлением воды. Осадок белка при этом вновь перейдет в раствор. А главное - белок сохранит свои нативные свойства, в том числе присущую ему биологическую активность (ферментативную, гормональную и т.д.). Важная особенность высаливания заключается в том, что по достижении критичной концентрации соли в осадок переходят «вдруг» сразу все молекулы соответствующего белка. Если в растворе содержатся и другие белки (более гидрофильные), то они остаются в коллоидном состоянии. Для их осаждения необходимо повысить концентрацию соли в растворе. Можно осуществить это после отделения предыдущего осадка (например, центрифугированием). Отсюда становится очевидной возможность дробного осаждения белков. Имеется в виду осаждение и отделение сначала наименее гидрофильных белков, затем все более и более гидрофильных. Так можно разделить сложную смесь белков на ряд порций (фракций). Каждая из них представляет собой обычно группу индивидуальных белков, сходных по выраженности гидрофильных свойств. Для дальнейшего разделения белков любой из фракций можно использовать не гидрофильность, а какое-либо из других физико-химических свойств макромолекул.

Достижения техники позволили разработать способ обратимого осаждения белков, который заключается в вымораживании белковых растворов в условиях вакуума. При этом осуществляется замораживание раствора, а затем сухое испарение (возгонка) льда. По существу, это уже не осаждение белка, а его высушивание («лиофильная сушка»). Многие белки полностью сохраняют при этом свои нативные свойства. Растворением сухого порошка можно восстановить его исходное коллоидное состояние. В сухом виде препараты белка сохраняются гораздо дольше (особенно, на холоде и при соблюдении стерильности). Из-за хорошей растворимости в воде их часто называют лиофили- зированными препаратами. В таком виде выпускаются теперь различные белковые вещества, применяемые в медицине (гормоны белковой природы; многие ферментные препараты; фибриноген и другие белки плазмы крови).

Высаливание белков сульфатом аммония.

Важным фактором устойчивости белков в растворе является наличие около частиц белка гидратной оболочки. Если к раствору белка прибавить соль, например (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, NaCl и др., то вследствие разрушения водных оболочек частицы белка обычно слипаются друг с другом, укрупняются и выпадают в осадок. Разные белки высаливаются при неодинаковых концентрациях одних и тех же солей. Глобулины, например, осаждаются в полунасыщенном растворе сернокислого аммония, тогда как альбумины — в насыщенном растворе этой соли. Высаливание белков является обратимой реакцией. Денатурации белков при этом не происходит.

Ход работы: Наливают в пробирку 1-1,5 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Наблюдают выпадение белого хлопьевидного осадка глобулинов. Мутную жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр. К фильтрату добавляют при перемешивании избыток сульфата аммония в порошке до прекращения его растворения. Появляется муть или хлопья выпадающих в осадок альбуминов. К осадку добавляют 2-3 кратное по объему количество воды и убеждаются в способности осадка к растворению.