3.2 Определение гемоглобина крови гемоглобинцианидным (фотоэлектроколориметрическим) методом

Приготовить опытную пробу. Для этого к 5 мл приготовленного трансформирующего раствора добавить 0,02 мл полученной из пальца цельной крови. Разведение крови в этом случае составит 251. Полученный раствор тщательно перемешать, выдержать 5–10 минут, а затем перенести в кювету фотоэлектроколориметра.

Приготовить кювету с трансформирующим раствором. Для этого отмерить 5 мл трансформирующего раствора и перенести его в аналогичную кювету (как для разбавленной крови).

Совместно с лаборантом произвести измерение согласно инструкции прибора. Измерения проводятся не менее 3 раз и затем вычислить среднюю арифметическую. Расчет содержания гемоглобина в исследуемой крови произвести по формуле:

где: Е_оп ― экстинкция опытной пробы;

Е_ст ― экстинкция стандартного раствора (определяется однократно для одного набора из 200 проб);

С ― концентрация гемоглобинцианида (59,8 мг/%);

К ― степень разведения крови (в 251 раз).

В выводе содержание гемоглобина в исследуемой крови сравнить с нормой. Перевести количество гемоглобина в единицы СИ. Для этого полученные по формуле значения умножить на 10 и выразить результаты в г/л.

Гемоглобин: Хромопротеид - глобин + гем ( протопорфирин IX + железо)

Формы гемоглобина (в норме):

HbA 1 (нормальный Нb взрослого) – 96-98% (у взрослых)

HbA 2 (минорный Hb взрослого) - 2-3%

Hb F (фетальный Hb) - 1-2%

Повышение концентрации Hb: эритроцитозы, эритремия, обезвоживание, физическая нагрузка, гипоксия, курение

Снижение концентрации Hb: анемии, гипергидратация

Гемоглобин (HB) — основной дыхательный пигмент эритроцитов, относящийся к хромопротеидам и обеспечивающий ткани кислородом; состоит из белка - глобина и гема - соединения протопорфирина IХ с железом.

Снижение концентрации гемоглобина в крови является основным лабораторным симптомом анемии. При этом содержание гемоглобина варьирует в широких пределах в зависимости от формы анемии и ее степени. Следует, однако, иметь в виду, что диагностика анемии ни в коей мере не может быть проведена лишь на основании определения концентрации гемоглобина в крови. Это исследование устанавливает только факт наличия анемии. Для уточнения ее характера необходимо исследование количества эритроцитов, цветового показателя, других расчетных индексов эритроцитов, морфологии эритроцитов.

Повышение концентрации гемоглобина в крови может наблюдаться при миелопролиферативных заболеваниях и симптоматических эритроцитозах, сопутствующих различным состояниям. Среди миелопролиферативных заболеваний наиболее характерно повышение гемоглобина при эритремии. Симптоматические реактивные эритроцитозы могут быть абсолютными (обусловлены пролиферацией элементов эритропоэза) и относительными (гемоконцентрационные). Физиологическое увеличение содержания гемоглобина свойственно новорожденным.

3.3 Подсчет количества эритроцитов

Для работы необходимы: микроскоп, счетная камера Горяева, ме-ланжер для эритроцитов, 3% раствор хлорида натрия, покровные стекла, автоматическая пипетка, пробирки, одноразовый скарификатор, вата, ан-тисептическое средство. Объект исследования ― кровь человека.

Перед началом работы необходимо рассмотреть счетную камеру под микроскопом, найти малые квадратики и большие квадраты сетки (рису-нок 1). Камеру предварительно необходимо подготовить путем притирания покровного стекла к боковым выступающим граням камеры до появления цветных (ньютоновских) колец. В каплю свежей крови, полученной из пальца, погрузить кончик меланжера (с красной бусинкой в расширении) для эритроцитов и набрать кровь до метки 0,5, следя, чтобы в капилляр не попали пузырьки воздуха. Быстро, пока кровь не свернулась, перенести кончик меланжера в 3% раствор хлорида натрия и набрать его до метки 101, т.е. развести кровь в 200 раз. После этого взять заполненный мелан-жер (смеситель), зажать его концы 1 и 3 пальцами и в течение 1 мин встря-хивать. После тщательного перемешивания крови, удалив предварительно 1–2 капли, нанести небольшую капельку на сетку камеры.

Заполнив камеру, поместить ее под микроскоп и, если форменные эле-менты расположены равномерно (что является показателем хорошего пе-ремешивания крови), приступить к подсчету. Считать эритроциты удобнее при большом увеличении.

Необходимо подсчитать число эритроцитов в 5 больших квадратах, рас-положенных в разных местах сетки, например, по диагонали. Во избежание двухкратного подсчета клеток, лежащих на границе между малыми квадра-тиками, руководствоваться правилом Егорова, согласно которому, относя-щимися к данному квадратику считаются эритроциты, лежащие как внутри квадратика, так и на его левой и верхней границе. Эритроциты, лежащие на правой и нижней границе для данного квадратика не учитываются.

Формула для вычисления количества эритроцитов в 1 мм³ крови:

где: N ― искомое число эритроцитов;

А ― число эритроцитов в 80 маленьких квадратиках (или в 5 больших);

4000 ― множитель для получения содержания эритроцитов в одном мм³ крови;

200 ― степень разведения эритроцитов.

Повышение количества эритроцитов в крови — эритроцитоз (более 6,0*10¹²/л у мужчин и более 5,0*10¹²/л у женщин) — один из характерных лабораторных признаков эритремии. Эритроцитоз может быть абсолютным (увеличение массы циркулирующих эритроцитов вследствие усиления эритропоэза) и относительным (вследствие уменьшения объема циркулирующей крови). Основные причины:

Эритроцитозы наблюдаются при:

- Врожденные и приобретенные пороки сердца

- Легочное сердце

- Эмфизема легких

- Пребывание на значительных высотах

- Болезнь и синдром Кушинга

- Лечение стероидами

- Дегидратация