Дифференциальный подсчет лейкоцитов.

Дифференциальный подсчет лейкоцитов заключается в регистрации всех встречающихся в поле зрения лейкоцитов раздельно по их принадлежности к тем или иным группам. Необходимо учитывать, что в мазке крови форменные элементы распределяются неравномерно. По краям препарата чаще встречаются моноциты и эозинофилы, а по середине — лимфоциты. Поэтому передвигать стекло надо в определенном порядке. Для под­счета лейкоцитов в обычно приготовленном мазке пользуются специальным методом, а именно: просматривают несколько полей зрения в одном направлении, затем изменяют направление и подсчитывают такое же количество полей зрения и снова изменяют направление (вдоль края, к центру, параллельно краю, и краю стекла и т.д.)

Обязательным является использование иммерсионной системы, так как обычные неиммерсионные объективы не дают достаточной четкости изображения и могут быть полезны только для "обзорных" просмотров. Чаще всего применяют объектив 90 õ 1,25 МИ (масляная иммерсия) и окуляр 7х или 10х. Иммерсионный объектив 70х обладает более широким полем зрения и очень удобен для анализа формулы крови, хотя и обладает меньшей разрешающей способностью. Для регистрации клеток используют лабораторный одиннадцатиклавишный счетчик СЛ-1 либо другие клавишные счетчики. В том случае, если не обнаружено отклонения от нормы, рекомендуется подсчитывать 100 клеток. При обнаружении патологии необходимо анализировать не менее 200 клеток, при этом особое внимание обращается на качественные изменения в эритроцитах и цитологическую структуру белых кровяных телец. Данные анализа лейкоформулы при подсчете на мазках в гематологии традиционно принято выражать в процентах, хотя необходимо всегда помнить об абсолютном содержании клеток.

При мануальном дифференциальном подсчете имеются 3 главных источника ошибок: неравномерное распределение клеток в препарате, неправильное распознавание клеток и статистическая погрешность. В первом случае имеет значение соблюдение правил передвижения препарата при дифференциальном счете клеток. Плохо приготовленный или плохо покрашенный мазок - основная причина ошибок, связанных с неправильным распознаванием клеток.

Наибольшая погрешность, однако, связана с тем, что подсчитывается малое количество клеток в образце — 100 или, в лучшем случае, 200. Увеличить количество регистрируемых клеток не представляется возможным, так как это сразу снизит произ­водительность лаборатории. В этом отношении чрезвычайно точны проточные гематологические счетчики, т.е. они анализируют, как правило, около 10 тыс. клеток, что на два порядка превышает возможности ручного подсчета.

Автоматизированные счетчики лейкоцитарной формулы.

Было предложено множество полуавтоматических и автоматических счетчиков, позволяющих уменьшить затрачиваемое время и повысить точность дифференциального подсчета лейкоцитов. Они не могут полностью заменить визуальный анализ мазка крови, который по-прежнему является "золотым стандартом" в гематологии. Пока еще нет прибора, способного надежно идентифицировать все незрелые или патологические клетки. Оценка подобных клеток требует участия квалифицированного морфолога. Существует два основных типа автоматов:

1. системы компьютерного анализа клеточного изображения с классифицированием клеток путем созданной модели распознавания;

2. проточные системы, идентифицирующие различные формы по размеру клетки и особенностям окрашивания.

Первый тип автоматов использует исследование мазков, окрашенных обычными методами, с применением движущегося микроскопного столика для перемещения препарата. При этом также используется иммерсионное масло. Клетки классифицируются и подсчитываются на основе созданной компьютерной модели распознавания. Большинство приборов также передают изображение клеток на телевизионный монитор, что позволяет идентифицировать клетки визуально. Нераспознанные клетки остаются в памяти компьютера и могут быть просмотрены позднее. Приборы с компьютерными программами способны просмат­ривать от 50 мл 800 клеток на 1 образец, исходя из затрачиваемого времени на 1 подсчет. Обычно устанавливается просмотр 100 клеток. Следовательно, в отношении статистики такие приборы не более точны, чем обычная мануальная техника, однако они позволяют производить исследование в 2-5 раз быстрее и уменьшают потребность в специально обученном персонале. Некоторые из этих приборов также запрограммированы на оценку морфологии красной крови, числа тромбоцитов и даже подсчет ретикулоцитов.

Другой тип автоматизированных систем — гематологические проточные анализаторы, которые являются специализированными многопараметровыми приборами с компьютерной обработкой сигналов, дающими оценку до 36 показателей в сочетании с графи­ческим представлением основных клеточных популяций. Преимуществами автоматического анализа по сравнению с ручными методами, а также с системами анализа изображения являются исключительно высокая производительность ( до 120 образцов в час) и значительно более высокая точность, поскольку анализу подвергается несколько тысяч клеток. Недостаток проточной цитометрии — отсутствие визуального анализа — на самых современных приборах (Gen-S, Coulter) компенсируется наличием специальной системы, обеспечивающей автоматическое приготовление мазка крови (slide-maker) включая его окраску и вывод изображения на экран монитора при помощи телевизионного мик­роскопа.

Отличительными свойствами автоматических гематологических анализаторов является:

1. автоматическое взятие и разведение пробы крови, которое может проводиться из открытых или закрытых пробирок (через прокол в резиновой пробке); использование на большинстве приборов методов предварительной обработки пробы, которая может заключаться в цитохимической окраске и дифференциальном лизисе клеток.

2. применение нескольких каналов для детекции сигналов; технология может включать использование кондуктометрического измерения объема (DC), радиочастотного анализа (RF), регистрации поглощения и рассеивания света, а также поляризации светорассеивания; в самое последнее время стали применять цитофлуориметрию (пока только для подсчета и анализа ретикулоцитов). Способы анализа и число измерительных каналов зависит от типа прибора; практически на всех анализаторах используется кювета для колориметрического определения гемоглобина цианметгемоглобиновым методом.

3. использование специальных компьютерных алгоритмов для подсчета клеток и представления конечных результатов.

В последние годы все больше практическое применение в КДЛ находит проточная цитометрия. Этот метод оказался очень ценным при изучении лейкозов, лимфом, ВИЧ, аутоиммунных заболеваний и иммунодефицитных состояний. ДНК - цитометрия позволяет анализировать анеуплоидные клеточные клоны, что является одним из важнейших критериев при диагностике злокачественных опухолей.Проточный цитометр по существу можно представить как усложненный микроскоп со способностью к быстрому количественному анализу множество свойств одиночных клеток, суспендированных в жидкой среде. Клетки по одной проходят через специальную камеру, пересекая пучок света высокой интенсивности, со скоростью несколько тысяч в секунду. Каждая клетка, проходя через луч света, испускает рассеянные и флуоресцентные световые сигналы. Эти сигналы регистрируются при помощи светочувствительных датчиков (фотоэлектронных умножителей и фотодиодов), усиливается и при помощи аналого-цифровых преобразователей переводятся в цифровые значения. Для переработки и хранения информации применяются компьютеры.

СКОРОСТЬ ОСЕДАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ (СОЭ)

Скоростью оседания эритроцитов называется скорость разделения не свернувшейся крови на 2 слоя: нижний, состоящий из осевших эритроцитов, и верхний из прозрачной плазмы. Величина СОЭ при определении наиболее распространенным в вашей стране микрометодом Панченкова у здоровых мужчин находится в пределах от 1 до 10 мм/ч, у здоровых женщин (вне менструации и беременности) -от 2 до 16 мм/ч.

При ряде патологических состояний СОЭ может увеличиваться. Предполагают, что одной из основных причин увеличения СОЭ является изменение соотношения между белко­выми фракциями крови в сторону увеличения крупнодисперсных белков. Играет роль и со­отношение между холестерином и лецитином. Уменьшение содержания эритроцитов также ведет к увеличению СОЭ.

Наиболее частой причиной увеличения СОЭ являются воспалительные заболевания самой различной этиологии: ревматизм, инфекционный полиартрит, пневмонии, туберкулез, плеврит, панкреатит, сепсис, абсцесс и гангрена легких, холецистит, эндокардиты (ревматический и бак­териальный) и т.д. При клинической картине, позволяющей предполагать воспалительное заболевание, увеличение СОЭ делает это предположение более вероятным. Повторные определения СОЭ дают основания для суждения о течении воспалительного процесса.

Необходимо учитывать, что увеличение СОЭ не всегда связано с воспалительным процессом в организме. Ниже приводятся наиболее частые причины, вызывающие увеличение СОЭ при отсутствии воспалительных процессов.

1. Беременность и менструации могут сопровождаться небольшим увеличением СОЭ.

2. Анемии. При уменьшенном содержании эритроцитов СОЭ увеличивается. Исключение составляют анемии, при которых имеется большое количество дрепаноцитов и сфероцитов, форма которых препятствует образовании их агломератов.

Л.С. Пироговым предложена формула, по которой может быть вычислена СОЭ при любом содержании в крови эритроцитов и отсутствии других патологических процессов.

СОЭ (мм/ч) =42-7,6 • х,

где х — число миллионов эритроцитов в 1 мкл крови (или, если строго придерживаться единиц СИ,— число триллионов эритроцитов в 1 л крови).

При анализе этой формулы легко убедиться в том, что колебания в содержании эритроцитов, наблюдающиеся в норме у здоровых людей, не вызывают отклонений величины СОЭ за пределы нормальных параметров. Следовательно, применение этой формулы имеет значение только у больных с анемиями или эритроцитозами (полицитемиями).

3. Гипопротеинемия. В клинической практике часто приходится встречаться, например, с увеличением СОЭ у больных с хроническими нефритами, особенно с нефротическим синдромом, у больных с нефрозами (даже при отсутствии в период исследования воспалительных процессов) и при других заболеваниях, протекающих с гипопротеинемией.

4. Парапротеинемии при множественной миеломе, болезни Вандельстрема. В этих слу­чаях увеличение СОЭ может достигать очень больших величин.

5. Злокачественные новообразования. При последних СОЭ часто (но не во всех случаях!) бывает значительно увеличена даже при отсут­ствии анемии и гипопротеинемии. Особенно увеличивается СОЭ при распаде опухоли.

6. Инфаркты миокарда, легких и др.

7. Частые гемотрасфузии, вакцинотерапия, серотерапия.

Большое практическое значение имеет знание тех патологических состояний, которые могут вызывать снижение СОЭ.

1. Выраженные явления недостаточности кровообращения могут нередко вызывать уменьшение СОЭ до 2-3 мм/ч. Так, увеличение СОЭ может отсутствовать у больных с выраженной не­достаточностью кровообращения при наличии явного ревматического эндокардита. СОЭ может не увеличиваться у больных с пневмониями при легочно-сердечной недостаточности.

2. Компенсаторные эритроцитозы и эритремии. В этих случаях снижение СОЭ зависит от увеличения числа эритроцитов. Зависимость изменений СОЭ от увеличения числа эритроцитов может быть подсчитана по приведенной выше формуле Л.С. Пирогова. В частности, нередко наблюдаемое отсутствие увеличения СОЭ при обострениях хронических неспецифиче­ских заболеваний легких может зависеть не только от недостаточности кровообращения, но и от компенсаторного эритроцитоза.

3. Вирусный гепатит и механические желтухи. Предполагают, что уменьшение СОЭ при этих патологических состояниях связано с накоплением в крови желчных кислот. Законе мерное уменьшение СОЭ при вирусном гепатите и увеличение при болезни Васильева—Вейля имеет некоторое дифференциально-диагноскическое значение.

4. Гиперпротеинемии.

5. Прием кальция хлорида, салицилатов и ртутных препаратов.

При всех перечисленных состояниях незначительное увеличение СОЭ может не соответствовать выраженности воспалительного процесса. На основании отсутствия увеличения СОЭ во всех этих случаях нельзя исключить возможности воспалительных процессов. Для выявления воспалительных процессов и суждения об их активности при этих состояниях приходится пользоваться другими методами исследований, в частности, определением С-реактивного белка и сиаловых кислот.

Нельзя забывать, что, несмотря на простоту определения, причиной изменений СОЭ могут быть технические погрешности, допущенные при исследовании.