Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

Keywords: cloning, gene, E. coli, recombinant lipase, producing strain, biocatalysts, interesterification

Microbial lipases are powerful tools for catalyzing not only hydrolytic breakdown of fats and oils, but the various reverse reactions of synthesis, in particular esterification, interesterification, and acidolysis, alcoholysis, aminolysis with the high regioand enantio-selectivity. Because of this, considerable attention has been given to the investigation of lipase-active heterogeneous biocatalysts.

The recombinant E. coli BL21(DE3) strain producing thermostable lipase from Thermomyces lanuginosus is constructed by cloning the synthetic gene in expressive vector. Synthetic gene is optimized for expression in E. coli cells. Recombinant strain rE.сoli/lip is ensured efficient expression of the synthetic gene. Quantity of synthesized recombinant enzyme reaches 30–40% of the total cell protein. It is found that recombinant lipase is localized in the cytoplasm predominantly in soluble form (about 70% of total recombinant enzyme), 20% of lipase is in the inclusion bodies and 10% in cell debris as insoluble form associated with the membranes. The thermal stability of recombinant lipase is found to be sufficiently high; and when heating rE.сoli/lip in olive oil (100°C), the inactivation constant and the half-life time are 6∙10–3 min–1and ~2 h, respectively.

The biocatalysts are prepared by entrapment of the whole cell rE.сoli/lip or the cells’lysates inside nanocarbon-in-silica composites. The continuous process of interesterification of the oil-fat blends is carried out in the packed-bed reactor at 70°С. For 100 h operation, the prepared biocatalysts retaine

above 80% of stationary activity.

УДК 602.4:547.455.623:007.573.6

БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЕЧАТНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ ДЛЯ МНОГОКОМПОНЕНТНОГО АНАЛИЗА ПОЛУПРОДУКТОВ БРОЖЕНИЯ Каманин С.С., Арляпов В.А., Решетилов А.Н.

ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет г. Тула, Россия

s.s.kamanin@gmail.com

Анонс: Разработан массив модифицированных печатных электродов, селективных по отношению к глюкозе, этанолу, лактату и крахмалу, для использования в составе биосенсора для мониторинга процесса брожения в реальном времени.

Ключевые слова: биосенсор, печатный электрод, бродильное производство.

В настоящее время каждый инструментальный метод анализа занимает свою нишу на рын - ке лабораторного оборудования, которая ограничивает целесообразность его применения для

определения содержания различных веществ. Однако биосенсоры на основе модифицирован- ных печатных электродов (МПЭ) могут служить базой для разработки унифицированного мето - да определения содержания различных веществ. В результате работы были получены МПЭ на основе берлинской лазури и ферментов: глюкозооксидазы, алкогольоксидазы, лактатоксидазы, и смеси γ-амилазы и глюкозооксидазы, иммобилизованных в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина. Диапазон определяемых содержаний для биосенсоров на основе по- лученных МПЭ составил соответственно 0,05–1,09 мМ глюкозы, 0,09–0,87 мМ этанола,

1–53 мМ лактата и 0,03–0,59 г/л крахмала. Коэффициент чувствительности для биосенсора на глюкозу составил 322 мкА·М-1, на этанол – 476 мкА·М-1, на лактат – 9,1 мкА·М-1, на крах-

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

мал – 670±20 нА·л/г. МПЭ, описанные в данной работе, были апробированы на образцах полупродуктов брожения.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук, договор № 14. Z56.14.330-МК и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития

научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы», соглашение № 14.574.21.0062.

BIOSENSOR BASED ON MODIFIED SCREEN-PRINTED ELECTRODES FOR MULTICOMPONENTANALYSIS OF SEMI-FERMENTED MASS

Kamanin S.S.,Arlyapov V.A., ReshetilovA.N.

Tula State University Tula, Russia s.s.kamanin@gmail.com

Announcement: Screen-printed electrodes array sensitive to the presence of glucose, ethanol, lactate and starch is developed for application in biosensor for on-line monitoring of fermentation process.

Keywords: biosensor, screen-printed electrode, fermentation production.

Nowadays every instrumental analytical method has its own niche in the market of laboratory equipment, which limits expediency of its application for the determination of various substances. However, biosensors based on modified screen-printed electrodes (MSPE) can serve as a basis for the development of a unified method for the determination of various substances. As result of the work MSPE, based on Prussian Blue and enzymes: glucose oxidase, alcohol oxidase, lactate oxidase and mixture of γ-amylase and glucose oxidase, immobilized in the gel of crosslinked bovine serum albumin, were obtained. The range detection range for biosensors based on developed MSPE amounted to 0.05–1.09 mM of glucose, 0.09–0.87 mM of ethanol, 1–53 mM of lactate and 0.03–0.59 g/l of starch. The sensitivity coefficient for glucose biosensor was 322 µA·M-1, ethanol biosensor – 476 µA·M-1, lactate biosensor – 9.1 µA M-1, starch biosensor – 670±20 nA·l/g. MSPE described in this paper were tested on samples of semi-fermented mass. Statistical methods established that glucose, ethanol, lactate and starch content, defined using MBE and the resulting reference methods (HPLC, gas chromatography, capillary electrophoresis, polarimetry respectively), differs insignificantly.

The work was supported by a grant of President of Russian Federation for state support of young Russian scientists – Ph.D., contract № 14.Z56.14.330-MC and the Federal Target Program “Research and development on priority directions of scientific-technological complex of Russia for 2014–2020”, the agreement № 14.574.21.0062.

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

УДК 636.084.414

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ УГЛЕВОДОВ В СОСТАВЕ СОЕВОЙ МУКИ Хабибулина Н.В., Красноштанова А.А., Полтева Е.Д.

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20, корп. 1

e-mail: ernestine2007@ya.ru

Проведен выбор ферментных препаратов и условий обработки, позволяющих провести наиболее глубокий гидролиз некрахмалистых полисахаридов в составе соевой муки. Показано, что при использовании сочетания целлюлазы и амилазы возможно получение фракций гидролизованных растворимых олигосахаров и обогащенного сырым протеином осадка.

Ключевые слова: соевая мука; некрахмалистые полисахариды; ферментативный гидролиз.

Настоящая работа подготовлена по результатам исследований, проведенных в рамках гранта Президента РФ для поддержки молодых российских ученых МК-4800.2014.4.

Высокое содержание некрахмалистых полисахаридов (18–23%) в соевой муке сдерживает её применение в кормопроизводстве, так как их наличие вызывает повышение вязкости содержимого кишечника сельскохозяйственных животных, что препятствует перевариванию корма. Для повышения питательной ценности кормов соевую муку обрабатывают ферментными препаратами [1].

В настоящей работе использовали экструдированную соевую муку и ферментные препараты, обладающие амилазной, ксиланазной, гемицеллюлазной и целлюлазной активностями. Показано, что при норме внесения 0,2–2% от массы субстрата в течение двух часов гидролиза наблюдается переход в жидкую фазу 20–70% углеводов. Наилучшие результаты были получены при использовании препарата Целловиридин Г20Х в сочетании с Верон БА, содержащем бактериальную амилазу. После отделения жидкой углеводной фазы осадок представляет собой фракцию соевого белка с содержанием сырого протеина 78–80%.

Список литературы:

1.  Бутейкис Г., Блажинскас Д. Ферменты – гарантия ощутимой выгоды сегодня и в будущем // Комбикорма. – 2012. – №. 3. – С. 105-106.

УДК 636.084.414

ENZYMATIC HYDROLYSIS OF CARBOHYDRATES IN SOY FLOUR Khabiboulina N.V., KrasnoshtanovaA.A., Polteva E.D.

Mendeleyev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia 125480, Moscow, Geroev Panfilovcev str., 20, building 1

e-mail: ernestine2007@ya.ru

An enzyme preparations and processing conditions selection for a full hydrolysis of non-starch polysaccharides containing in the soy flour was made. It is shown that it is possible to receive soluble oligosaccharides and protein-rich residue using a combination of cellulase and amylase. Keywords: soy flour; non-starch polysaccharides; enzymatic hydrolysis.

This paper was prepared on the results of research carried out under a grant from the President of the Russian Federation for support of young Russian scientists MK–4800.2014.4. Soy flour are widely used in feed, however, high levels of non-starch polysaccharides (18–23%) containing in soy flour promotes intestinal contents of farm animals viscosity increasing, which pre-

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

vents the digestion of food. To improve the nutritional value of forage soybean meal treated with enzymes [1].

In this paper an extruded soybean meal and enzyme preparations with activities of amylase, xylanase, cellulase and hemicellulase were used. It is shown that during firsttwo hours a transition into the liquid phase 20–70% of carbohydrates can be observed, the dosage of enzyme preparations reached 0.2–2% by weight of the substrate. Best results were obtained using the preparation Celloviridin G20X combined with Veron BAcomprising bacterial amylase.After separation of the liquid carbohydrate fraction from unhydrolyzed part the residue has a crude protein content of 78–80%.

List of references:

1.  Buteikis G., Blajinskas D. Enzymes – a guarantee tangible benefits now and in the future // Kombikorma – 2012. – № 3. – PP. 105-106.

УДК 602.6

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГИДРОЛИЗАТОВ МУКИ ЗЕРНОВЫХ И ЗЕРНОБОБОВЫХ КУЛЬТУР ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ Хромова Н.Ю., Кареткин Б.А., Грошева В.Д., Шакир И.В., Панфилов В.И.

Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, 125047, г. Москва, Миусская площадь, д. 9, кафедра биотехнологии. E-mail: khromova-natalya@bk.ru

Ключевые слова: пробиотики, растительное сырье, питательные среды, лактобациллы

В настоящее время в мире наблюдается повышение интереса и спроса на пробиотические продукты функционального назначения. Питательные среды для культивирования пробиотических микроорганизмов должны быть сбалансированы по химическому составу, в частности по источникам азота, витаминов, микро- и макроэлементов. Исключение из состава питательной среды дорогостоящих компонентов позволяет снизить затраты на культивирование. Наиболее доступным и приемлемым по химическому составу для этих целей является возобновляемое растительное сырье. В настоящей работе исследована возможность применения муки зерновых и зернобобовых культур в качестве основного компонента питательных сред для культивирования лактобацилл.

Культивирование проводили глубинным способом в микроаэрофильных условиях при температуре 37°C. На первом этапе в качестве питательной среды использовали термически предобработанную муку. После 48 ч роста наибольший титр клеток (3·109 KOE/мл) и повышение кислотности среды достигались на ржаной муке. Рост на других субстратах был значительно ниже. На втором этапе для повышения доступности протеина субстрат подвергали обработке протеолитическим ферментным препаратом Protex 40E. При культивировании в средах, под- вергнутых ферментативному гидролизу, титр клеток повышался на 2 порядка для питательных сред на основе гречишной, пшеничной и гороховой муки до 2·108, 3·109 и 2·109 KOE/мл, со- ответственно. При культивировании в среде с ржаной мукой по сравнению с первым опытом

существенных изменений не наблюдали.

Таким образом, наиболее подходящим субстратом для культивирования лактобацилл яв-

ляется ржаная мука, как обработанная, так и необработанная ферментом, либо подвергнутая

протеолизу пшеничная и гороховая мука. Интерес для дальнейших исследований представляет

оптимизация ферментативной обработки субстрата и культивирование на гидролизатах с под- держанием pH.

302 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

UDC 602.6

HYDROLYSATES OF CEREALAND PEAFLOUR FOR CULTIVATION OF LACTOBACILLI Khromova N.Yu., Karetkin B.A., Grosheva V.D., Shakir I.V., Panfilov V.I.

D. Mendeleyev University of Chemical Technology of Russian, 125047, Moscow, Miusskaya Square, 9, Department of Biotechnology E-mail: khromova-natalya@bk.ru

Keywords: probiotics, plant material, culture media, lactobacilli

At present, the world has witnessed increased interest in and demand for functional probiotic products. Hence, the nutrient medium for probiotic microbes fermentation is to have balanced chemical composition, in particular nitrogen sources, vitamins, micro and macro elements. Exclusion of expensive components from the culture medium reduces the cost of fermentation. The renewable plant material is the most affordable and acceptable chemical composition for the purpose discussed. The possibility of flour of grains and legumes use as a major component of culture media for the fermentation of lactobacilli was investigated.

The cultivation was performed in a deep way in microaerophilic conditions at 37°C. At the first stage a thermally preprocessed flour was used as the nutrient medium. The highest value of the medium acidity has been achieved by the 48 hour on rye flour, and the number of viable bacteria cells was 3·109 CFU/ml. Other substrates showed significantly lower growth. Proteolytic enzyme Protex 40E treatment was used to improve the availability of the protein substrate during the second stage. When cultured in the medium exposed to enzymatic hydrolysis, the number of cells increases 2 orders of magnitude for culture media based on buckwheat, wheat and pea flour, 2·108, 3·109 and 2·109 CFU/ ml, respectively. No significant changes were observed for the medium with rye flour compared to the first embodiment.

Thus, rye flour, both treated by the enzyme and not or proteolysed wheat and pea flour are suitable substrate for the cultivation of lactobacilli. Optimization of substrate enzymatic treatment and cultiva-

tion on hydrolysates obtained is of interest for further investigations.

УДК 579.61

ПРОДУКЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА (рчАФП) В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ PICHIA PASTORIS

Морозкина Е.В.1, Вавилова Е.А.1, Зацепин С.С.1, Дудич И.В.2, Семенкова Л.Н.2, Беневоленский С.В.1 1Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва, Россия, 119071 Москва, Ленинский просп., 33, стр. 2

2ОАО “Институт Инженерной Иммунологии” Чеховский р-н, 142380, пос. Любучаны, Московская обл.

e-mail: chicelena@yandex.ru

Сконструирован штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris – продуцент рекомбинант- ного негликозилированного альфа-фетопротеина (рчАФП0) человека. Синтезируемый белок обладает противоопухолевой активностью, аналогичной природному эмбриональному альфа- фетопротеину (эАФП) человека.

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

Ключевые слова: рекомбинантный альфа-фетопротеин человека, Pichia pastoris, противоопухолевая терапия.

Альфа-фетопротеин (АФП) обладает огромным терапевтическим потенциалом при лечении рака и аутоиммунных заболеваний и может быть использован для регенерации тканей. Применение эмбрионального АФП (эАФП) лимитировано отсутствием доступного источника сырья. Получение рекомбинантного негликозилированного АФП (рчАФП0) явилось необходимым условием для изучения структурно-функциональных свойств белка и его дальнейшего применения в медицине. В ходе работы синтезирован ген рчАФП0 и создан штамм-продуцент рчАФП0 в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris, секретирующий целевой белок в культуральную жидкость. Оптимизация и масштабирование ферментационного процесса позволили увеличить выход рчАФП0 до уровня 20 мг/л. Разработан протокол выделения и очистки биоло - гически активного рчAFP0. Изучение функциональной активности рчAFP0, проведенное in vitro на двух модельных системах – подавление роста раковых клеток посредством индукции апоптоза и ингибирование пролиферации митоген-активированных лимфоцитов, показало, что данный белок проявляет противоопухолевую активность аналогичную природному эАФП.

ENGINEERING OFTHE METHYLOTROPHIC YEAST PICHIA PASTORIS PRODUCING

RECOMBINANT HUMANALPHA-FETOPROTEIN

Morozkina E.V.1, Vavilova E.A.1, Zasepin S.S.1, Semenkova L.N.2, Dudich I.V.2, Benevolensky S.V.1 1A.N.Bach Institute of Biochemistry RAS, Moscow, Russia, 119071, Moscow, Leninsky prosp., 33, building 2

2Institute of Immunological Engineering, Lyubuchany, Moscow Region, Chekhov district, 142380, Russia e-mail: chicelena@yandex.ru

Pichia pastoris yeast strain producing recombinant human alpha-fetoprotein was constructed. Functional tests demonstrated similar type of tumor suppressive and immunosuppressive activity for recombinant AFP as compared to natural embryonic one.

Keywords: Recombinant human alpha-fetoprotein; Pichia pastoris; tumor suppression

Alpha-fetoprotein (AFP) is a candidate of biological drug with high potential for treatment of autoimmune diseases, cancer, and in regenerative medicine. It is known that the source of natural serum humanAFPis limited thus large scale production of recombinant human alpha-fetoprotein (rhAFP) is desirable for structural and functional studies and applied research.

In this study we cloned and expressed in the secreted form non-glycosylated human rhAFP0 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. For increasing rhAFP0 production, the conditions for yeast fermentation have been optimized. As a result the total yield of rhAFP0 production in culture liquid increased up to 20 mg/L. RhAFP0 were successfully produced and purified from the cultural liquid as

active naturally folded protein.

Functional activity of rhAFP0 was studied in vitro in two model protocols – growth suppression

of tumor cells by induction of apoptosis and inhibition of proliferation of mitogen-activated lym-

phocytes. It was confirmed that rhAFP0 anti-tumor activity is equal to this parameter for embryonic AFP.

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

УДК 543.068.8

МОДИФИКАЦИЯ ВНУТРЕННЕЙ ПОВЕРХНОСТИ ФОТОННО-КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ВОЛНОВОДОВ В РАЗРАБОТКЕ БИОСЕНСОРОВ Пиденко С.А., Пиденко П.С., Бурмистрова Н.А., Горячева И.Ю.

Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия 410012, Саратов, ул. Астраханская, 83

e-mail: naburmistrova@mail.ru

Дли использования в качестве основы для биосенсоров при проведении клинических анализов получены образцы фотонно-кристаллических волноводов (ФКВ), модифицированных сернокислым раствором пероксида водорода и алкиламиносиланами. Исследовано влияние концентрации реагентов и времени обработки внутренней поверхности на спектральные характеристики ФКВ.

Ключевые слова: фотонно-кристаллические волноводы, биосенсор, модификация поверхности.

Уникальные оптические свойства фотонно-кристаллических волноводов (ФКВ) позволяют рассматривать их как перспективную основу для разработки биосенсоров, которые могут быть применены в различных областях медицины и биотехнологии. Особый интерес представляют ФКВ с модифицированной внутренней поверхностью, которая позволяет осуществлять ковалентное и не ковалентное связывание низко- и высокомолекулярных веществ.

В работе использованы ФКВ с большим периодом решетки структурной оболочки. Особенности спектральных характеристик данных ФКВ позволяет получать отклик на незначительные изменения показателя преломления среды, заполняющей каналы в структуре волноводов. Измерения спектральных характеристик ФКВ проводили на анализаторе Ocean Optics HR4000, изучение поперечных сечений – на микроскопе Carl Zeiss Axiostar Plus. Установлено, что обработка внутренней поверхности ФКВ раствором смеси концентрированных H2SO4 и Н2О2 наблюдается смещение полос в спектре пропускания ФКВ. При этом величина сдвига зависит от концентрации Н2О2 и времени обработки. Исследование образцов методом сканирующей электронной микроскопии показало отсутствие нарушений и изменений морфологической структуры ФКВ. Установленные закономерности позволяют управлять плотностью формирования поверхностного слоя активных ОН-групп и были успешно использованы для оптимизации дальнейшей модификации ФКВ алкиламиносиланами.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект 14-13-00229.

УДК 543.068.8

VARIATIONS IN INNER SURFACE OFAPHOTONIC-CRYSTALFIBERS DEVELOP BIOSENSORS

Pidenko S.A., Pidenko P.S., BurmistrovaN.A., Goryacheva I.Y.

SaratovStateUniversity, Saratov, Russia

83  Astrakhanskaya Street, Saratov, 410012 e-mail: naburmistrova@mail.ru

The samples of photonic crystal fibers (PCF) modified by sulfuric acid solution of hydrogen per- oxide and alkyl aminosilanes for use as a basis for biosensors for clinical analyzes were obtained. The

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

influence of the concentration of the reactants and the processing time on the spectral characteristics of the PCF were investigated.

Keywords: photonic crystal fibers, biosensor surface, modification.

Unique optical properties of photonic crystal fibers (PCF) can be considered as promising tools for the development of a biosensor matrix, which can be applied in various fields of medicine and biotechnology. The objects of particular interest are the PCF with the modified internal surface, which permits covalent and non-covalent binding of the lowand high-molecular substances.

PCF with large lattice shell structure were used in the work. There spectral characteristics allows to receive a response of a very small fluctuations of the refractive index of the medium filling the channels in the waveguide structure. The spectral characteristics of PCF were performed on the analyzer Ocean Optics HR4000, cross-sectional study – on the microscope Carl Zeiss Axiostar Plus.

The treatment of the inner surface of the PCF with a solution of concentrated H2SO4: H2O2 leads to displacement of the fringes in the transmission spectrum of the PCF. The magnitude of the shift depends on the concentration of H2O2 and processing time. Examination of the samples by scanning electron microscopy showed no irregularities and changes in the morphological structure of the PCF. Established laws allow you to control the density of the formation of the surface layer of active OH groups and have been successfully used to optimize further modification PCF by alkyl aminosilanes.

The work was supported by the Russian Scientific foundation (project 14-13-00229).

НОВЫЕ МАКРОПОРИСТЫЕ БИОСОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ КРИОГЕЛЕЙ, СФОРМИРОВАННЫХ ИЗ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА Родионов И.А.1, Лозинский В.И.1, Александрова А.Е.2, Бакеева И.В.2

1Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН,

ул. Вавилова 28, 119991 Москва, РФ; е-mail: ilyarodionov2@gmail.com

2ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В.Ломоносова»

Криогели – особый класс макропористых полимерных гелей, формируемых в неглубоко замороженной среде. В зависимости от природы предшественников, а также режимов за- мораживания-оттаивания, могут быть получены криоструктураты, отличающиеся по своим физико-химическим свойствам и морфологии. Большой интерес с точки зрения практики представляют криогели на основе белков. Такие гелевые материалы биосовместимы и могут применяться в качестве биосорбентов. Исследование зависимости основных характеристик ма-

кропористых белковых криогелей от параметров процесса криоструктурирования дает инфор-

мацию для направленного дизайна структуры и эксплуатационных качеств данных материалов.

В качествебелка-предшественниканамибылиспользованбычийсывороточныйальбумин

(БСА). В результате денатурации нативной глобулы БСА под действием хаотропных агентов

пространственно закрытые -S-S связи в присутствии низкомолекулярных SH-агентов могут

вступать в реакции тиол-дисульфидного обмена, что обуславливает возможность формиро -

вания трехмерной сетки. Согласно второму использованному в работе подходу гелевая сетка

образуется также при взаимодействии сшивающего агента с функциональными группами

белка.

Исследовано влияние исходных концентраций белка и сшивателей, а также режимов про- цесса криоструктурирования на свойства получаемых криогелей. Показано, что полученные

306 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

БСА-криогели могут использоваться в качестве биосорбентов. Оценка их сорбционных свойств проведена с помощью модельного вещества – L-триптофана. Найдено, что сорбционная емкость криогелей зависит от способа их получения, соотношения белок : реагент, а также от температуры криотропного гелеобразования.

NOVELMACROPOROUS BIO-ABSORBENTS ON THE BASIS OF CRYOGELS PREPARED FROM SERUMALBUMIN

I.A.Rodionov1, V.I.Lozinsky1,A.E.Alexandrova2, I.V.Bakeeva2

1A.N. Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds, RAS, Vavilov str. 28, 119991, Moscow, Russian Federation,

е-mail: ilyarodionov2@gmail.com

2M.V.Lomonosov Moscow State University for Fine Chemical Technology

Cryogels represent a unique family of polymeric gels formed in moderately frozen medium. The cryostructurates thus obtained may differ by their physical chemical features and morphology depending on the nature of precursors used, as well as on the freezing-storing-defrosting mode. Protein based cryogels are of great interest in regard to their possible application. Such gel-like materials are biocompatible and can be utilized as bio-absorbents. Study of the relationship between the properties of macroporous protein-based cryogels and parameters of their fabrication process allows obtaining the information for further targeted design of structure and performance of these materials.

In this study we have utilized bovine serum albumin (BSA) as a protein precursor. Denaturation of the BSA native globule conformation exposed to the chaotropic agents results in previously spacehidden -S-S-bonds reacting via thiol-disulfide exchange in the presence of low-molecular-weight SHcontaining agents, thus giving rise to the formation of 3D-network.According to the second approach utilized in this work the gel network was formed under the reaction of the cross-linking agent with functional groups of the protein.

Impact of the initial concentration of peptide and cross-linking agents, as well as the freezing-stor- ing-defrosting mode on the characteristics of the BSA-cryogels formed was studied. It has been demonstrated that the resultant cryogels can be employed in the capacity of bio-absorbents. Evaluation of their absorptive properties was carried out using L-tryptophan acting as a model compound. It was found that value for the absorption capacity depends on the route of the gel-formation, as well as

on the protein-to-reagent ratio, and furthermore on the temperature of cryotropic gel-formation.

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

УДК 663.15

ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКОАКТИВНОЙ ФОРМЫ РЕКОМБИНАНТНОЙ ТИРЕОПЕРОКСИДАЗЫ ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКУЛОВИРУСНОЙ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ

Шеметова Е.Б., Сорокин М.А., Иванов К.А., Плетнёв Д.Н., Некрасова Н.A., Бабкина И.Н., Данилюк Н.К., Рукавишников М.Ю.

ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирск, Россия 630117, Новосибирск, ул Арбузова 1/1 danilyuk@vector-best.ru

С использованием бакуловирусной системы экспрессии получена рекомбинантная тиреопероксидаза человека, высокоактивная в ИФА со специфической панелью сывороток.

Ключевые слова: тиреопероксидаза, бакуловирусная система экспрессии, Sf9.

Аутоиммунный тиреоидит Хашимото, послеродовой тиреоидит и диффузный токсический зоб сопровождаются появлением в крови больного аутоантител к тиреопероксидазе (ТПО) – ключевому ферменту биосинтеза тиреоидных гормонов. Общее количество больных с аутоиммунным повреждением щитовидной железы достигает в европейских странах нескольких процентов населения.

ЦельюработыбылосозданиенаосноверекомбинантногобелканепрямойИФАтест-системы для количественного определения антител к ТПО в сыворотке крови больных. Поскольку ТПО является гликопротеином со сложными структурными эпитопами, его продукцию осуществляли с использованием бакуловирусной системы экспрессии.

На основе системы Bac-to-Bac была собрана векторная конструкция, в составе которой под контроль конститутивного промотора гена полиэдрина была помещена кодирующая область гена ТПО человека за исключением 3’-концевой последовательности, кодирующей трансмембранный домен. В той же рамке считывания были помещены последовательности, кодирующие сигнальный полипептид белка мелиттина, а также 6-his- и strepтаги.

Экспрессию рекомбинантного белка проводили в суспензионной культуре клеток Sf9 в среде TNM-FH, 10% FBS. Нарабатываемый белок был растворим и эффективно секретировался в среду до концентрации нескольких миллиграммов на литр. Показано влияние на эффективность наработки таких параметров как плотность клеточной культуры, время наработки, а также содержание в среде некоторых добавок (гематин и др.). Очистку рекомбинантного ТПО осуществляли из культуральной среды при помощи аффинной хроматографии на смоле Ni-NTA, либо Strep-Tactin®. Трудности очистки рекомбинантного белка из культуральной среды удалось минимизировать переходом к средам с пониженным содержанием сыворотки. Очищенный реком- бинантный ТПО человека проявлял высокую специфическую активность в ИФА.