Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

The gas-vortex bioreactor is a unique device in which liquid is mixed by a structured air vortex, without a stirrer immersed in liquid. This provides gentle but effective 3D mixing of liquids including viscous ones without foaming at a power consumption decreased by dozens of times.

Gas-vortex bioreactors are currently used for production of vaccines, drugs (FSUE “Armavir Biofactory” UE ““Vitebsk Biofactory”…), blood substitutes at JSC “Gelenpol” and microbiological products for agriculture (JSC “Bisolbi Inter”, JSC “Biotroph”...) as well as in enzymatic hydrolysis of raw grain (CJSC “Irmen stock-farm”, CJSC “Biryuli” ...), etc.

Vortex bioreactors of the new generation can replace inefficient low-tech roller, “egg” and “mattress” technologies in the production of vaccines and other drugs significantly reducing their costs and ensuring compliance with GMP.

Stem cells and other autologous human cells are successfully cultivated in the gas-vortex bioreactor of the “personal doctor” type, which allows for their preparative production for personalized medicine, that enables the creation of apparatus for personalized medicine.

Specifications and extremely low energy consumption determin the effectiveness of gas-vortex bioreactor in large processes, where the prime cost of the product mainly includes the cost of the electricity consumed.

The use of gas-vortex bioreactors by industrial enterprises and research institutes will expand the range of tasks solved, accelerate the adoption introduction of new developments by industry, improve manufacturabilityand production safety,will reduce production costsand environmental pressurethus providing rapid development of the industrial component of the Russian biotechnological clusters.

УДК 62.33.31

СЕМЕЙСТВО СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ПЛАЗМИДНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Воробьев И.И., Орлова Н.А., Ковнир С.В., Ходак Ю.А., Габибов А.Г., Скрябин К.Г.

Учреждение Российской академии наук Центр „Биоинженерия“ РАН, Москва, Россия 117312  Россия, Москва, пр-т 60-летия Октября д.7, корп.1

e-mail: ptichman@gmail.com

Разработано семейство экспрессионных векторов, обеспечивающих высокую частоту инсерции целевых генов в геном клеток линии CHO и быструю амплификацию интегрированных генетических кассет. Получаемые с его помощью клональные продуценты терапевтических белков обладают высокой удельной продуктивностью и достаточной стабильностью для промышленного использования.

Ключевые слова: линии-продуценты; CHO; EEF1a.

Высокаяипостояннаяудельнаяпродуктивностьявляетсяосновнымтребованиемк промыш- ленным линиям-продуцентам терапевтических белков. Существующие плазмидные векторы не всегда позволяют получить линии клеток млекопитающих с требуемыми свойствами. Нами раз- работан вектор p1.1, содержащий нетранслируемые участки гена фактора элонгации трансля- ции 1a китайского хомячка, фрагмент конкатемера концевого повтора вируса Эпштейна-Барр и селекционный маркер – дигидрофолатредуктазу. С помощью p1.1 получен продуцент фактора свертываемости крови VIII с удельной продуктивностью более 10 мкМЕ/клетка/день и посто- янным уровнем секреции в течение 120 дней. Для ко-трансфекции нескольких генов созданы производные вектора p1.1 с различными селекционными маркерами. Они использованы для создания линии-продуцента фактора свертывания крови IX с удельной продуктивностью 2.1

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

мкМЕ/клетка/день и долей неактивной формы фактора IX менее 3%. Для создания продуцентов гетеродимерных белков применен трицистронный вектор, в котором открытые рамки считывания целевых генов объединены интактным внутренним сайтом связывания рибосом вируса энцефаломиокардита. Получена клональная линия-продуцент фолликулостимулирующего гормона человека с удельной продуктивностью 12 пг/клетка/день, секретировующая преимущественно корректную гетеродимерную форму гормона. Плазмидный вектор p1.1 и его произ - водныепригодныдлябыстрогополучениявысокопродуктивныхлинийклетокмлекопитающих, секретирующих белки различных типов.

Orlova N.A.et al. Improved elongation factor-1alpha-based vectors for stable high-level expression of heterologous proteins in Chinese hamster ovary cells//BMC Biotechnol. 2014. Vol. 14. № 56.

УДК 62.33.31

SPECIALIZED PLASMID VECTORS FOR EXPRESSION OFTHERAPEUTIC PROTEINS IN MAMMALIAN CELLLINES

Vorobiev I.I., Orlova N.A., Kovnir S.V., Khodak Y.A., GabibovA.G., Skryabin K.G.

Centre „Bioengineering“ Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia 117312, Moscow, 7 bld.1, 60-letija Oktyabria av.

e-mail: ptichman@gmail.com

We have developed the family of expression vectors, allowing high genome integration frequency in the CHO cells and rapid genome amplification of inserted genetic cassettes. Resulting clonal cell lines, secreting threpeutic proteins possesses high specific productivity and sufficient long-term stability for industrial use.

Keywords: producer cell lines; CHO; EEF1a.

High and stable specific productivity is the key feature of industrially employed cell lines, secreting pharmaceutical proteins. In some cases existing plasmid vectors don’t allow to obtain cell lines with the properties needed. We have developed plasmid vector p1.1, containing non-translating areas of the translation elongation 1-a gene from Chinese hamster, fragment of the concatemer of the terminal repeat from Epstein-Barr virus and selection marker dihydrofolate reductase. Utilizing this vector we obtained the cell line, secreting blood clotting factor VIII with the specific productivity over 10 µIU/cell/day and unchanged secretion rate for 120 days of periodic culturing. Derivatives of the p1.1 vector with various selection markers were created and employed for development of the cell line, secreting clotting factor IX with the specific productivity 2.1 µIU/cell/day and less than 3% of inactive form of factor IX.

We employed a tricistronic vector, containing the intact internal ribosome entry site from encepha-

lomyocarditis virus between open reading frames of target genes for creation of cell lines, secreting

heterodimeric proteins. Clonal cell line, secreting human follicle stimulating hormone (FSH) with the

specific productivity 12 pg/cell/day mostly in the correct heterodimeric form, was developed. Plasmid

p1.1 and derivative plasmids are suitable for rapid development of highly productive cell lines, secret-

ing various recombinant proteins.

Orlova N.A.et al. Improved elongation factor-1alpha-based vectors for stable high-level expres- sion of heterologous proteins in Chinese hamster ovary cells//BMC Biotechnol. 2014. Vol. 14. № 56.

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

УДК 544.726.3

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА БЕТАЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ СОРБЦИОННЫМИ МЕТОДАМИ Воронина Н.В., Котова Н.В., Глазова Н.В.

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия» министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург, Россия 197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14

e-mail: nefimenko88@mail.ru

Проведено исследование процессов сорбции бензилпенициллина, 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) и фенилуксусной кислоты (ФУК) на различных сорбентах с целью разделения компонентов данной смеси.

Ключевые слова: сорбция, фенилуксусная кислота, бензилпенициллин, модельный раствор.

Ферментативный гидролиз бензилпенициллина используется при производстве 6-АПК. По технологии производства, существующей в настоящее время, общий выход целевого продукта составляет около 60%, остальные 40% являются отходами, в которых содержатся бензилпенициллин, 6-АПК и ФУК.

В качестве сорбента для исследования был выбран молекулярный носитель Полисорб (ПС), на основе которого были получены модифицированные носители анионного и катионного ти - пов. На модельных растворах подобраны оптимальные условия проведения процесса сорбции исследуемых веществ. Показана возможность выделения из смеси ФУК, которая может ис - пользоваться как ценный реактив. Максимальная емкость сорбции ФУК достигается на мо - дифицированной форме ПС – сульфокатионите. Наибольший коэффициент распределения для бензилпенициллина получен на сорбенте анионного типа. Показано, что сорбция 6-АПК на данных носителях происходит неэффективно и для ее выделения из смеси предлагается ис - пользовать метод осаждения. Разработана схема разделения продуктов реакции энзиматического гидролиза бензилпенициллина с использованием модифицированных форм молекулярного сорбента Полисорб.

UDC 544.726.3

FRACTIONATION OFTHE PRODUCTS OF HYDROLYSIS OF BETA-LACTAM ANTIBIOTICS WITH USING SORPTION METHODS

Voronina N.V., Kotova N.V., Glasova N.V.

Saint-Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy, 197376, Russia, St. Petersburg, prof. Popov street, 14.

e-mail: nefimenko88@mail.ru

The study processes of sorption benzylpenicillin, 6-aminopenicillanic acid (6-APA) and phenyl- acetic acid (FAA) on various sorbents with the purpose to separate components of this mixture was conducted. Keywords: sorption, phenylacetic acid, benzyl penicillin, model solution.

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

Enzymatic hydrolysis of penicillin is used in the production of 6-APA. According to the technology existing in the present time, the overall product yield is approximately 60%, the remaining 40% are wastes that contain benzylpenicillin, 6-APA and FAA.

Asa sorbentfor studywas selected molecular sorbent Polysorb(PS)on the basisof whichwere obtained modified carriers the anionic and cationic types. Optimal conditions of the sorption of studied substances were selected on the model solutions. Was shown the possibility of separation FAA from the mixture, which can be used as a valuable reagent. The maximum capacity of the sorption FAA is achieved on the modified form of PS – sulphocationite. The highest distribution ratio for penicillin was obtained on the sorbent of anionic type. It is shown that the sorption of 6-APA on these carriers are ineffective and for its separation from the mixture suggested to use the method of precipitation. The scheme for separation of products of enzymatic hydrolysis of penicillin was developed with using modified forms of the molecular sorbent Polysorb.

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

ПОСТЕРЫ

POSTERS

УДК 62.41.31

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА СУБСТАНЦИЙ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ РЕЛИЗ-АКТИВНЫХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ ИФА Борщева А.А., Дон Е.С., Моногаров Г.В., Тарасов А.В., Никифорова М.В., Тарасов С.А.

ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг», Москва, Россия.

127473, Москва, 3-й Самотечный пер, д 9. e-mail: borshchevaaa@materiamedica.ru

Разработана методика ИФА для оценки активности антител к интерферону гамма человека в рамках контроля качества субстанции. Методика позволяет определить пригодность субстанции для производства препаратов на основе релиз-активных антител.

Ключевые слова: иммуноферментный анализ, контроль качества, интерферон гамма, антитела.

ООО «НПФ «МАТЕРИА МЕДИКА ХОЛДИНГ» представляет препараты для лечения различных заболеваний, где в качестве действующего вещества используются поликлональные антитела в релиз-активной форме (РА-антитела)[1].

При контроле качества субстанций для антительных препаратов необходимо оценить актив- ность,опосредующуюфармакологическиеэффекты.МеханизмдействияРА-антителзаключает- ся в способности оказывать прямое модифицирующее действие на целевой антиген [1], в связи

сэтим для контроля качества антительной субстанции используется метод иммуноферментного анализа, доказывающий способность антител специфически связываться с антигеном.

Нами была разработана и валидирована методика ИФА для определения активности антител к интерферону гамма человека (ИФНγ). Была выбрана конкурентная схема, где за связывание

сантигеном конкурируют стандартные биотин-меченые и исследуемые поликлональные антитела. Титр антител в образце выражают в нг IC50. Валидационные параметры были выбраны на основании рекомендаций ICH Q2 и успешно подтверждены.

Разработанная методика позволяет оценить активность антител к ИФНγ – параметр, определяющий эффективность препаратов на основе РА-антител.

1.  Эпштейн ОИ. Феномен релиз-активности и гипотеза «пространственного» гомеостаза//

Усп Физиол наук, 2013, том44, №3, с. 54–76.

UDC 62.41.31

ELISAFOR QUALITY CONTROLOF DRUG SUBSTANCES OF RELEASE-ACTIVE ANTIBODY PREPARATIONS

A.A. Borshcheva, E.S. Don, H.V. Monogarov,A.V. Tarasov, M.V. Nikiforova, S.A. Tarasov

OOO “NPF “Materia Medica Holding”, Moscow, Russia.

3d Samotechny per., buil. 9, Moscow,127473. e-mail: borshchevaaa@materiamedica.ru

An ELISA procedure has been developed intended for activity evaluation of antibodies to human interferon gamma as part of QC assessment of the drug substance. The assay allows determining ap- plicability of the substance for the manufacture of drug products based on release-active antibodies. Keywords: ELISA, quality control, interferon gamma, antibodies.

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

“OOO”NPF”MATERIA MEDICA HOLDINGS” has designed a range of drug products for the treatment of various diseases, with the active substance represented by polyclonal antibodies in re- lease-active form (RA-antibodies) [1].

For quality control of drug substances to be used for the preparation of antibody drugs, studies should be performed to evaluate the activity underlying pharmacological effects. The mechanism of action of RA-antibodies is based on their ability to directly modify the target antigen [1]. Therefore quality control of antibody substances has to be performed by using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to demonstrate the antibodies’ specific antigen binding.

We have developed and validated ELISA procedure for activity determination of antibodies to human interferon gamma (IFNγ). For the assay a competitive protocol was chosen where reference biotin-labeled and test polyclonal antibodies compete for antigen binding. Antibody titers of assayed samples were expressed as ng IC50. The validation parameters were defined based on the guideline ICH Q2 and successfully confirmed.

The developed procedure enables evaluation of anti-IFNγ antibody’s activity – key parameter in efficacy assessment of RA–antibodies-based drugs.

1.  O.I. Epstein (2013) Release-activity phenomenon and “spatial” homeostasis hypothesis // Usp. Fiziol. Nauk (Advan. Physiol. Sci.), 44(3): 54–76.

УДК 579.083.13: 579.25

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЛАКТОБАЦИЛЛ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Чижаева А.В., Дудикова Г.Н., Амангельды А.А., Велямов М.Т.

Казахский научно-исследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности, Алматы, Казахстан 050060, Алматы, пр. Гагарина,238 «Г»

E-mail: anna_chizhaeva@mail.ru

Штаммы лактобацилл в составе консорциума для препарата-пробиотика идентифицированы методом определения прямой нуклеотидной последовательности фрагмента 16s rRNA гена, а также с применением видоспецифических праймеров. Определен уникальный набор фрагментов ДНК, характерных только для данных штаммов (ПЦР-фингерпринт).

Ключевые слова: ПЦР, гены, видоспецифические праймеры, фингерпринт.

Молекулярно-генетическая оценка лактобацилл необходима для проведения родовой и видовой идентификации культур на этапе подбора штаммов-продуцентов в состав пробиоти- ков, для контроля стабильности штаммового состава на всех этапах производства препаратов. Нами был создан пробиотический препарат на основе лактобацилл и послеспиртовой барды. Для уточнения видовой принадлежности культур в составе препарата нами была проведена генетическая идентификация штаммов 67, 22 и 104 методом определения прямой нуклеотид - ной последовательности фрагмента 16s rRNA гена. Два штамма был идентифицированы как Lactobacillus pontis 67 и Lb. casei 22. Однако, учитывая высокую консервативность нуклео- тидной последовательности 16s rRNA гена, филогенетический анализ не позволил провести четкую видовую дифференциацию штамма 104 на Lb. paracasei или Lactobacillus rhamnosus. ПЦР-идентификация с применением видоспецифических праймеров: LU-5, RhaII, Lpar-4, Lac- 2. позволила отнести исследуемый штамм 104 к виду Lactobacillus paracasei. Далее с исполь- зованием праймеров М13 и 1254 нами был проведен ПЦР-фингерпринт всех трех штаммов,

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

определивший уникальный набор фрагментов ДНК, характерных только для данных штаммов. Полученные данные о молекулярно-генетической структуре исследованных штаммов внесены в генетические паспорта штаммов.

UTC 579.083.13: 579.25

MOLECULARAND GENETICASSESSMENT OF LACTOBACILLI BY PRODUCTION OF PROBIOTIC PREPARATIONS

ChizhayevaA.V., Dudikova G.N.,AmangeldiA.A., Velyamov М.Т.

Kazakh research institute of the processing and food industry, Almaty, Kazakhstan 050060, Almaty, Gagarin av., 238 «G»

E-mail: anna_chizhaeva@mail.ru

Strains of lactobacilli in consortium for a preparation probiotics are identified by method of definition of direct nucleotide sequence of a fragment 16s rRNA gene, and also with application of spe- cies-specific primers. The unique set of fragments of DNA, characteristic only for these strains (PCR-fingerprint) is defined.

Keywords: PCR, genes, species-specific primers, fingerprint.

The molecular and genetic assessment of lactobacilli is necessary for carrying out genusand species-identification of cultures at a stage of selection of strains-producers in structure of probiotics, for control of stability of strains structure at all stages of preparation productions. We created the probiotic preparation on the basis of lactobacilli and post alcohol bards. For specification of species accessory of cultures as a part of the preparation we carried out genetic identification of strains 67, 22 and 104 by method of definition of direct nucleotide sequence of the fragment 16s rRNA gene. Two strains are identified as Lactobacillus pontis 67 and Lb. casei 22. However, considering high conservatism of nucleotide sequence 16s rRNA gene, the phylogenetic analysis didn’t allow to carry out accurate species differentiation of the strain 104 on Lb. paracasei or Lactobacillus rhamnosus. PCR-identification with application of species-specific primers: LU-5, RhaII, Lpar-4, Lac-2 allowed carrying the studied strain 104 to the species of Lactobacillus paracasei. Further with use of primers of M13 and 1254 we carried out PCR-fingerprint all three strains, the defined unique set of fragments of DNA characteristic only for these strains. The obtained data on molecular and genetic structure

of the studied strains are brought in genetic passports of strains.

УДК 577.11.083

КОБАЛЬТ-ЗАВИСИМАЯ ЭКСПРЕССИЯ – НОВЫЙ ТИП РЕГУЛЯЦИИ КАТАБОЛИТНЫХ ГЕНОВ В БАКТЕРИЯХ RHODOCOCCUS

Гречишникова Е.Г., Шемякина А.О., Лавров К.В., Герасимова Т.В., Яненко А.С.

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов,

113545, Москва, 1-ый Дорожный пр., 1, т. (495) 315-01-83, e-mail yanenko@genetika.ru

На модели штамма R. rhodochrous М8 aam, содержащего ген ациламидазы под контролем ре- гуляторной области генов нитрилгидратазы, продемонстрирована кобальт-зависимая экспрес- сия гена.

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

Ключевые слова: Rhodococcus, амидаза, нитрилгидратаза, кобальт, промотор, экспрессия генов.

Введение. Утилизация органоцианидов (нитрилов) штаммом Rhodococcus rhodochrous М8 с участием ферментов нитилгидратазы и амидазы подвержена сложной регуляции, которая включает системы индукции и репрессии. В штамме R. rhodochrous М8, активность нитрилгидратазы – ключевого фермента утилизации нитрилов – индуцируется мочевиной и зависит от присутствия в среде ионов кобальта, которые входят в состав активного центра фермента. Изучение влияния кобальта на образование нитрилгидратазы в клетках R. rhodochrous М8 затруднено тем, что в отсутствие кобальта не наблюдается синтез активного фермента.

Результаты. Для изучения особенностей функционирования кобальт-зависимой регуляции в клетках родококкков были сконструирован штамм (R. rhodochrous М8 aam), у которого регуляторная область нитрилгидратазы слита с репортерным геном (ациламидазы) и исследована активность репортерного гена при разных условиях роста. Штамм был получен путем заме - щения генов нитрилгидратазы с использования нереплицирующихся в родококках гибридных плазмид. Активность ациламидазы в отличие от нитрилгидратазы не зависит от ионов кобальта, что позволяет использовать ген ациламидазы в качестве репортерного для изучения кобальт-за- висимой экспрессии.

Штаммы R. rhodochrous М8 и R. rhodochrous М8 aam выращивали на минимальной синтетической среде с глюкозой, и индукторами (мочевиной, кобальтом), и определяли активности ферментов в клетках, а также содержания белка нитрилгидратазы и ациламидазы.

Оказалось,чтов отличиеотнитрилгидратазы,синтезациламидазынаблюдаетсятакжеив отсутствие кобальта в среде. Однако при добавлении кобальта ациламидазная активность клеток вырастает в три раза и при этом резко увеличивается содержание белка ациламидазы в клетках (по результатам SDS-ПААГ электрофореза). Таким образом, уровень экспрессии репортёрного гена ациламидазы под контролем промоторной области нитрилгидратазы регулируется ионами

кобальта. Кобальт–зависимая регуляция экспрессии гена является первым примером металло- зависимой регуляции катаболитных генов в клетках бактерий Rhodocoсcus.

SECTION | | “BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY”

COBALT DEPENDENT EXPRESSION – NOVELTYPE OF GENE EXPRESSION REGULATION FOR CATABOLIC GENES IN RHODOCOCCUS BACTERIA

Grechishnikova E.G., ShemyakinaA.O., Lavrov K.V., Gerasimova T.V., YanenkoA.S..

State Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, 113545, 1-st Dorojny pr., 1, Moscow, Russia, fax +7 495 315 05 01

e-mail yanenko@genetika.ru

Cobalt influence on nitrilehydratase promoter activity of the model strain R. rhodochrous М8 aam was demonstrated. This strain has a substitution of the nitrilehydratase genes with an acylamidase gene aam, which fused with nitrilehydratase promoter.

Keywords: Rhodococcus, amidase, nitrilehydratase, cobalt, promoter, gene expression.

Introduction. Organocyanide (nitrile) utilization by Rhodococcus rhodochrous М8 strain is carried out with nitrilehydratase and amidase enzymes. This utilization is being under the complicated regulation, which involves induction and repression of gene expression. An expression of the nitrilehydratase – a key enzyme of nitrile utilization – is induced by urea. Also there is some data about cobalt influence on gene expression. However, detailed study of cobalt influence on gene expression on the Rhodococcus rhodochrous М8 strain was restricted, because normal folding and enzyme activity of the nitrilehydratase is impossible without cobalt.

Results. To more detailed studying of cobalt dependent regulation in rhodococcal cells, the R. rhodochrous М8 aam strain with a substitution of the nitrilehydratase genes with an acylamidase gene aam was constructed. Gene substitution was created via homologous recombination and plasmids, nonreplicable in Rhodococcus. Acylamidase activity is not metal-dependent, and can be used as a reporter to estimate the influence of cobalt on nitrilehydratase promoter activity.

R. rhodochrous М8 и R. rhodochrous М8 aam strains was cultivated on minimal synthetic media with glucose and putative promoter inductors – urea, cobalt. Then enzyme activities and specific protein amount was estimated in grown up cells.

It turned out, that, in contrast to nitrilehydratase, acylamidase syntheses observed in the absence of cobalt in media. However addition of cobalt raised up the acylamidase activity of cells 3 fold, and also specific protein amount (estimated by SDS-PAGE). So that, level of acylamidase reporter gene under the control of nitrilehydratase promoter region is regulated by cobalt. Cobalt dependent regulation of gene expression is the first example of metal-dependent regulation for catabolic genes in Rhodococcus bacteria.

СЕКЦИЯ | | «БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»

УДК 577.154.2 + 542.952+ 579.22; 577.152.1

РЕКОМБИНАНТНАЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ЛИПАЗА ИЗ THERMOMYCES LANUGINOSUS: ПОЛУЧЕНИЕ И БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Беклемишев А.Б.1, Коваленко Г.А.2,3, Перминова Л.В.2, Мамаев А.Л.1, Пыхтина М.Б.1 1ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, Новосибирск, Россия 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2

2Институт катализа СО РАН им. Г.К. Борескова, Новосибирск, Россия 3Новосибирский государственный Университет, Новосибирск, Россия e-mail: beklem@niibch.ru

Получен штамм E. coli (rE.сoli/lip) – продуцент термостабильной липазы из Thermomyces lanuginosus. Исследована внутриклеточная локализация липазы, её активность и термостабильность. На основе лизатов клеток rE.сoli/lip приготовлены гетерогенные биокатализаторы для переэтерификации триглицеридов растительных масел.

Ключевые слова: клонирование, ген, E. coli, рекомбинантная термостабильная липаза, штамм-продуцент, биокатализатор, переэтерификация

Создание рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих, например, термостабильные липазы, является актуальной задачей биотехнологии, поскольку данные ферменты осуществляют конверсию триглицеридов в ценные продукты.

Штамм E. coli, продуцирующий липазу из Thermomyces lanuginosus, получен путем клонирования синтетического гена липазы, оптимизированного для экспрессии в клетках E. coli BL21(DE3). Рекомбинантный штамм rE.сoli/lip обеспечивает эффективную экспрессию синтетического гена, при этом количество фермента достигает 30–40% от общего клеточного белка. Около 70% рекомбинантной липазы локализовано в растворимой форме в цитоплазме, 20% найдено в телах включения и 10% – в клеточном дебрисе в связанной с мембранами форме. Липаза обладает высокой термостабильностью; при нагревании в оливковом масле (100°С) константа инактивации и время полу-жизни составляли 6∙10–3 мин–1 и ~2 ч, соответственно.

С использованием целых клеток rE.сoli/lip и их клеточных лизатов приготовлены гетерогенные биокатализаторы для непрерывного процесса переэтерификации масложировых смесей. Данные биокатализаторы сохранили ~80 % стационарной активности через 100 ч работы при

70°С.

УДК 577.154.2 + 542.952+ 579.22; 577.152.1

RECOMBINANT THERMOSTABLE LIPASE FROM THERMOMYCES LANUGINOSUS: PRODUCTIONAND BIOCATALYTIC PROPERTIES

BeklemishevA.B., Kovalenko G.A., Perminova L.V., MamaevA.L., Pykhtina M.B.

Institute of Biochemistry, 630117 Novosibirsk, Russia

Institute of Catalysis, 630090 Novosibirsk, Russia

The recombinant E. coli strain (rE. coli/lip) producing a thermostable lipase from Thermomyces

lanuginosus is constructed. The intracellular localization of lipase in rE. coli/lip, its activity and

thermal stability are studied. Heterogeneous biocatalysts are prepared by entrapment of the rE.soli/

lip cell’ lysates inside nanocarbon-in-silica xerogel composites and studied in the triglycerides’inter- esterification.