Журнал неврологии и психиатрии / 2010 / NEV_2010_03_083

реактивов DIAtom™ DNA Prer 100 (Isogene Lab.ltd, Россия) по протоколу производителя. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на программируемом термоциклере МС2 («ДНК-технология», Россия) с использованием ДНК-полимеразы Biotaq («Биомастер») в объеме 25μ1 реакционной смеси. Поиск мутаций осуществляли методом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру как с прямого, так и с обратного праймеров, на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) с использованием протокола производителя. В качестве матрицы для секвенирования использовали фрагменты ДНК, полученные после проведения ПЦР с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров (SYNTOL). Анализ результатов секвенирования проводили с помощью программ Chromas и BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast).

Клиническое обследование включало генеалогический анализ, общий и неврологический осмотр, электронейромиографию (ЭНМГ), определение активности креатинфосфокиназы (КФК) в крови, МРТ головного мозга, у 2 больных — исследование мышечного биоптата (световая и электронная микроскопия). Иммуногистохимическое исследование мерозина в мышечной ткани не проводили.

Результаты

Мутации LAMA2 обнаружены у 3 неродственных больных. Семьи П. и У. русские, родители не состоят в кровном родстве; семья С. этнически смешанная (русскотатарская); все пробанды — единственные дети в семьях. Представляем описания больных и результаты ДНКдиагностики.

Больной С. — ребенок от 1-й беременности, протекавшей с угрозой прерывания. Роды в 38 нед — экстренное кесарево сечение после длительного периода десинхронизации родовой деятельности (узкий таз у матери), в родах асфиксия плода. Масса тела при рождении — 3350 г, длина — 51 см, оценка по Апгар 7/8 баллов. С рождения отмечались выраженная мышечная гипотония и низкая двигательная активность, в связи с чем исключали спинальную амиотрофию Верднига—Гофмана. При ЭНМГ в 1,5 мес переднероговая активность и признаки первичного поражения мышц отсутствовали; выявленное снижение скоростей распространения возбуждения по периферическим нервам было расценено как физиологическая гипомиелинизация.

Впервые консультирован в Медико-генетическом научном центре (МГНЦ) в возрасте 2 мес. Отмечены выраженная диффузная мышечная гипотония, особенно в аксиальных мышцах и проксимальных мышцах конечностей, ограничение объема движений, арефлексия (синдром «вялого ребенка»), значительное переразгибание в коленных и голеностопных суставах с подвывихами, дисплазия тазобедренных суставов с подвывихом бедер. При МРТ были выявлены изменения перивентрикулярного белого вещества и гипоплазия мозолистого тела. Болезнь была расценена как последствия перинатального поражения ЦНС. В дальнейшем резко отставал в двигательном развитии: в 5 мес начал держать голову, но только при вертикальном положении тела; с 11 мес сидел, будучи посаженным, самостоятельно не садился; полностью не поворачивался, не ползал; движения в кистях были сохранны.

В психоречевом развитии имелось небольшое отставание

сположительной динамикой.

Ввозрасте 1 года 8 мес ребенок был направлен в МГНЦ вновь с подозрением на лейкодистрофию: так были расценены выраженные изменения плотности белого вещества теменно-затылочных и лобно-теменных долей при повторной МРТ. Клинически имел место выраженный проксимальный миопатический синдром без симптомов поражения ЦНС, психоэмоциональное развитие соответствовало возрасту. Было обращено внимание на повышенную активность КФК (500 Ед/л, возрастная норма до 200 Ед/л), оказавшуюся еще более высокой при повторном исследовании (850 Ед/л). Ранний тяжелый миопатический синдром с высокой КФК в сочетании с характерным поражением белого вещества мозга позволил нам диагностировать ВМД с поражением головного мозга и запланировать ДНК-диагностику (семья предполагала дальнейшее деторождение).

Первой была начата менее затратная ДНК-диагнос- тика ВМД1С (ген FKRP), при которой тоже возможна гипомиелинизация мозга. При секвенировании фрагмента экзона 4, где концентрируются мутации FKRP, изменения нуклеотидной последовательности не были обнаружены. Продолжение ДНК-диагностики семья отложила.

Позже была проведена мышечная биопсия: патоморфологическая картина с множественными некрозами и атрофией мионов без признаков структурных миопатий соответствовала ВМД. Активность КФК колебалась в пределах 1300—600 Ед/л. При повторных ЭНМГ имелись признаки первичного поражения мышц и гипо/демиелинизации периферических нервов. К 4 годам у ребенка наросла мышечная атрофия, сформировались контрактуры коленных, голеностопных, плечевых и локтевых суставов; сила в проксимальных отделах рук и ног — 2 балла; интеллект сохранный, негрубые дислалия и дизартрия.

При ДНК-диагностике ВМД1А найдены две ранее не описанные мутации LAMA2 в компаунд-гетерозиготном состоянии: с.5422С>Т (Glnl808Stop) и c.7701delTinsGTGT CCCTAGGTGTCCCTA. Первая из них — нонсенс-мута- ция, ведущая к формированию преждевременного стопкодона в экзоне 37 и нарушению формирования I и II доменов мерозина. Вторая мутация со сдвигом рамки считывания изменяет аминокислотную последовательность экзона 55, в результате чего нарушается формирование С-терминального региона.

Больная П. родилась от 2-й беременности (1-я — мертворождение), протекавшей с угрозой прерывания в I и II триместрах, выраженным токсикозом, гестозом. Роды на 36-й нед путем кесарева сечения из-за угрозы гипоксии плода. Масса тела при рождении — 3050 г, длина — 50 см, закричала сразу, оценка по шкале Апгар 8/8 баллов. На 2-е сутки взяла грудь, выписана из родильного дома на 8-е сутки. В 1,5 мес заметили снижение двигательной активности и мышечную гипотонию.

На момент первого осмотра в МГНЦ в 5 мес не держала голову, не переворачивалась, при вертикализации не опиралась на ноги; отмечены сниженная двигательная активность, диффузная мышечная гипотония, арефлексия (синдром «вялого ребенка»), формирующиеся контрактуры локтевых, коленных, голеностопных суставов и межфаланговых суставов кистей. Клиническая картина указывала на ВМД или — с меньшей вероятностью — врожденную структурную миопатию. Для уточнения диагноза

были рекомендованы мышечная биопсия и МРТ головного мозга.

При биопсии, проведенной только спустя 2 года, подтвержден диагноз ВМД: обнаружена выраженная атрофия мышечных волокон в сочетании с грубым разрастанием соединительной ткани, признаков структурных миопатий и феномена «рваных красных мышечных волокон» не найдено.

Девочка осмотрена повторно в 3,5 года. За период наблюдения не приобрела основных двигательных навыков: не переворачивается, самостоятельно не садится, не стоит. Наросли мышечные атрофии и контрактуры суставов, объем движений в конечностях минимальный, сила в мышцах рук — 3 балла, мышцах ног — 2 балла; отмечено вовлечение в процесс лицевой мускулатуры: гипотония мимических и жевательных мышц. Негрубо отстает в психоречевом развитии, речь дизартрична. Активность КФК 710 Ед/л. ЭНМГ: признаки первичного поражения мышц (значительное снижение амплитуды М-ответа с разрежением интерференционной кривой) в сочетании с признаками демиелинизирующей полинейропатии (скорость распространения возбуждения по срединному нерву снижена до 43 м/с, по большеберцовому — до 34 м/с). Эхокардиография: дилатация левого желудочка, пролапс митрального клапана, открытое овальное окно. МРТ (в 4,5 года) выявила характерную перивентрикулярную гипомиелинизацию.

При ДНК-диагностике найдены две ранее не описанные мутации LAMA2 в компаунд-гетерозиготном состоянии: С.38290Т (Argl277Stop) и c.7536delC. Первая мутация, точковая, изменяет аминокислотную последовательность экзона 26 и приводит к нарушению формирования IVa домена мерозина. Вторая мутация изменяет аминокислотную последовательность экзона 54, вследствие чего нарушается формирование С-терминального участка. Делеция одного нуклеотида в данном случае привела к образованию преждевременного стоп-кодона в положении 2546.

Больной У. обследован в МГНЦ в возрасте 6 лет. Беременность и роды протекали физиологично, оценка по Апгар 8/9 баллов, масса тела при рождении — 3600 г, длина

— 50 см. В 1-е сутки жизни выявлены кривошея и подвывих левого бедра. В 3 мес начал держать голову, никогда самостоятельно не садился, не вставал, не ходил. Уже на 1-м году жизни была выявлена повышенная активность КФК (1100 Ед/л). Наблюдался с диагнозом: миопатия.

При осмотре отмечены диффузная мышечная слабость с вовлечением мимических и жевательных мышц, гипотрофия, гипотония, арефлексия, контрактуры коленных, голеностопных, локтевых, плечевых и межфаланговых суставов, «седловидная» деформация грудной клетки (рис. 1, а). Речь имеет гнусавый оттенок вследствие арковидной деформации неба и свисания небной занавески (при сохранных глоточном и небном рефлексах). Интеллект соответствует возрасту. При МРТ головного мозга выявлены множественные очаги демиелинизации в перивентрикулярных отделах (рис. 1, б). Активность КФК в этот период нормализовалась (170 Ед/л).

При ДНК-диагностике была обнаружена одна ранее не описанная мутация LAMA2 в гетерозиготном состоянии: замена С.6406ОТ в экзоне 45, приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона в положении 2136 (Gln2136Stop) (рис. 1, в). Хотя вторую мутацию обнаружить не удалось, с учетом типичной клинической картины подтвержден диагноз ВМД1А.

МЫШЕЧНАЯ ДИСТРОФИЯ

а

б

в

Рис. 1. ВМД1А у больного У.

а — больной 6 лет; б — МРТ: множественные очаги демиелинизации в перивентрикулярных областях; в — фрагмент электрофореграммы. Стрелкой отмечена замена С на Т в гетерозиготном состоянии, соответствующая мутации Gln2136Stop.

чай иллюстрирует также достаточное разнообразие МРТкартины при ВМД1 А. Действительно, помимо изменений белого вещества (степень и локализация которых варьируют), описаны локальная дисплазия коры (пахигирия, микрополигирия), гипоплазия червя мозжечка, мозолистого тела, гипофиза [5, 7, 17, 19, 21]; как и поражение белого вещества, эти дополнительные МРТ-признаки чаще не проявляются клинически. Наконец, известны случаи ВМД1А без изменений МРТ [16, 23]. Таким образом, клинический спектр ВМД1А значительно шире, чем предполагалось. Это надо учитывать при отборе больных для молекулярно-генетической и иммуногистохимической диагностики, не ограничиваясь «классическим» фенотипом.

Продолжительность жизни при ВМД1А варьирует от нескольких лет при очень тяжелых формах до 30 лет и более. Специфичного лечения нет.

Таблица позволяет сравнить ВМД1А и другие ВМД с поражением головного мозга (в таблицу не включены их общие признаки: тяжелый миопатический синдром и ранние контрактуры). Видно, что синдромальные ВМД (Фукуямы, Уокера-Варбург и МЕВ) имеют большое сходство, тогда как ВМД1А значительно отличается от них, особенно по степени поражения ЦНС. За сходством трех синдромальных форм стоит их патогенетическая близость: все соответствующие гены кодируют ферменты, обеспечивающие гликозилирование α-дистрогликана (эти ВМД называют также дистрогликанопатиями). Мерозин же принадлежит к структурным белкам базальной мембраны и экстрацеллюлярного матрикса, что сближает ВМД1А с рядом «чистых» ВМД, гены которых кодируют белки той же группы (трех цепей коллагена 6-го типа, интегрина 7-типа). Эти белки тесно взаимодействуют между собой (рис. 2).

Клинические признаки ВМД1А находят объяснение в характеристиках гена и белка: очень раннее начало большинства случаев объясняется участием мерозина в формировании мышечных волокон в эмбриогенезе; полинейропатия и демиелинизация головного мозга при ВМД1А отражают экспрессию LAMA2 не только в поперечнополосатых мышцах (базальной мембране), но также в периферических нервах и ЦНС (главным образом в шванновских клетках и синаптических структурах).

Полипептидная цепь мерозина включает 3088 аминокислот и 22 сигнальные последовательности и имеет доменную структуру. 6 белковых доменов выполняют специфические функции в белковой молекуле. В мышечном волокне мерозин локализован в экстрацеллюлярном матриксе и обеспечивает сцепление белков сарколеммы и коллагеновых волокон. Он представляет собой гетеротример, состоящий из трех полипептидных цепей — тяжелой цепи α2 и двух легких цепей β1 и γ1. Выделяют длинное плечо и 3 коротких плеча мерозина. Длинное плечо сформировано 3 закрученными вдоль оси полипептидными цепями и стабилизируется дисульфидными связями и взаимодействует с белками дистрогликанового комплекса саркомеры мышечных волокон. Короткие плечи формируют крестообразную структуру и обеспечивают связь мерозина с коллагеном 6-го типа межклеточных пространств (рис. 3). Предполагается, что основная функция ламинина α2 заключается в обеспечении сцепления и правильной ориентации миофибрилл мышечного волокна посредством его взаимодействия с коллагеновыми структурами межклеточных пространств и белками сарколеммы.

Другие симптомы

МРТ мозга

Течение

Эпидемиология

Взаимодействие мерозина с белками сарколеммы осуществляется с помощью 2 механизмов. С одной стороны, он является лигандом α-дистрогликанов, входящих в дистрофин-гликопротеиновый комплекс, с другой — он взаимодействует с мембранным рецептором миофибрилл

—интегрином (см. рис. 3).

Внастоящее время зарегистрировано более 200 мутаций LAMA2 у почти 600 больных [15, 28]. Наиболее типичны делеции и мутации, приводящие к образованию стоп-кодона (как и в наших наблюдениях), тогда как миссенс-мутации редки. Имеются гено-фенотипические корреляции: при легком течении болезни чаще обнаруживают мутации без сдвига рамки считывания [15, 28]. Доля молекулярно-генетически подтвержденных случаев у больных с предварительным клиническим диагнозом ВМД1А в разных исследованиях варьирует. В выборке J. Oliviera и соавт. [19] она очень высока: 96% (25 из 26 больных). Это обеспечивается не только строгим отбором больных (у большинства предварительно проведено иммуногистохимическое исследование), но и применением широкого спектра методов ДНК-анализа, что позволило наряду с точковыми мутациями и малыми делециями и инсерциями обнаружить крупную делецию гена у 8 больных. Рутинные же методы анализа ДНК не выявляют атипичные мутации LAMA2 (в частности, крупные делеции), доля которых достигает 30—40%. Этим объясняется «отсутствие» второй мутации у больного У. В семьях Д. и В., где мутации не были обнаружены, также возможна ВМД1А с атипичными мутациями LAMA2. В подобных случаях для подтверждения диагноза проводят иммуногистохимическое исследование мерозина в мышечной ткани. При верифицированном диагнозе возможна дородовая ДНКдиагностика с использованием косвенных методов. Отметим, что дефицит мерозина в мышцах сам по себе не патогномоничен для ВМД1 А. В частности, он выявлен при

Рис. 3. Строение ламининов.

ВМД1В [6]. Эта «чистая» ВМД описана всего в 2 семьях разной этнической принадлежности, ген картирован в локусе lq42. Авторы считают, что дефицит мерозина в обеих семьях носит вторичный характер и косвенно указывает

на связь ВМД 1В с одним из белков, взаимодействующих с мерозином. Возможность неспецифичного дефицита мерозина надо учитывать при иммуногистохимических исследованиях.

Таким образом, в диагностике и дородовой диагностике ВМД1А наиболее надежен комплексный подход, сочетающий иммуногистохимические методы, прямые и косвенные методы ДНК-анализа. В мире накоплен значи-

тельный опыт пренатальной диагностики ВМД1А. M. Vainzhof и соавт. [26] обобщили материал 5 центров, где за 1995—2004 гг. было проведено 114 пренатальных исследований: комплексный подход обеспечил высокую надежность диагностики без ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Основой генетической профилактики ВМД1А в отягощенных семьях является ее своевременная диагностика у больных.

патией. Журн неврол психиат 1993; 5: 27—29.

2.Руденская Г.Е., Галкина В.А., Дунаевская Г.Н. Редкие формы наследственных прогрессирующих мышечных дистрофий с контрактурами. Теоретические и прикладные проблемы мед. генетики. М 1993; 105— 119.

3.Руденская Г.Е., Дадали Е.Л., Ситников В.Ф. Наследственная сочетанная церебро-мышечная патология в детском возрасте. Организационные и клинические проблемы детской неврологии и психиатрии. М 1993; 253—255.

4.Allamand V., Guicheney P. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy, autosomal recessive (MDC1A, MIM #156225, LAMA2 gene coding for α2 chain of laminin). Neurology 2002; 10: 91—94.

5.Barkovich A. Pediatric Neuroimaging Lippincott, Williams and Wilkins, 4th Ed. 2005.

6.Brockington M., Sewry C., Herrmann R. et al. Assignment of a form of congenital muscular dystrophy with secondary merosin deficiency to chromosome 1q42. Am J Hum Genet 2000; 66: 428—435.

7.Buteica E., Rosulescu E., Burada F. et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy type 1A. Rom J Morphol Embryol 2008; 49: 229—233.

8.Chae J., Lee J., Hwang H. et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy in Korea. Brain Dev 2009; 31:341—346.

α2 chain (merosin) abnormalities: case series and review. J Med Genet 2001;

38: 649—657.

17.Leite C., Lucato L., Martin M. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy (CMD): a study of 25 Brazilian patients using MRI. Pediat Radiol 2005; 35: 572—579.

18.Lisi M., Cohn R. Congenital muscular dystrophies: new aspects of an expanding group of disorders. Biochim Biophys Acta 2007; 1772: 159—172.

19.Oliviera J., Santos R., Soares-Silva I. et al. LAMA2 gene analysis in a cohort of 26 congenital muscular dystrophy patients. Clin Genet 2008; 74: 502— 512.

20.Peat R., Smith J., Compton A. et al. Diagnosis and etiology of congenital muscular dystrophy. Neurology 2008; 71: 312—321.

21.Philpot J., Cowan F., Pennock J. et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy: the spectrum of brain involvement on magnetic resonance imaging. Neuromuscul Disord 1999; 9: 81—85.

22.Prandini P., Berardinelli A., Fanin M. et al. LAMA2 loss-of- function mutation in a girl with congenital muscular dystrophy. Neurology 2004; 63: 1118—1121.

23.Sewry C., Naom I., D’Alessandro M. et al. Variable clinical phenotype in merosin-deficient congenital muscular dystrophy associated with differen-

tial immunolabeling of two fragments of the laminin α2 chain. Neuromuscul Disord 1997; 7: 169—175.

genital muscular dystrophy. Variable epitope expression in severe and mild cases. Neurology 1998; 51: 94—100.

10.Di Blasi C., Mora M., Pareyson D. et al. Partial laminin α2 chain deficiency in a patient with myopathy resembling inclusion body myositis. Ann Neurol 2000; 47: 811—816.

11.Di Blasi C., Piga D., Brioschi P. et al. LAMA2 gene analysis in congenital muscular dystrophy. New mutations, prenatal diagnosis, and founder effect. Neurology 2005; 62: 1582—1586.

12.Habeeb Y., Al-Jumah E., De Souza T. Congenital muscular dystrophy in Arab children. J Child Neurol 2006; 21: 400—405.

13.Helbling-Leclerc A., Zhang X., Topaloglu H. et al. Mutations in the laminin alpha 2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nat Genet 1995; 11: 216—218.

14.Hillaire D., Leclerc A., Faure S. et al. Localization of merosin-negative congenital muscular dystrophy to chromosome 6q2 by homozygosity mapping. Hum Mol Genet 1994; 3: 1657—1661.

15.Human Gene Mutation Database at the Institute of Medical Genetics in Cardiff (HGMD): http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php

genital muscular dystrophy with partial laminin alpha2 (LAMA2) deficiency. Hum Mutat 2003; 21: 103—111.

25.Tome F., Evangelista T., Leclerc A. et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. С R Acad Sci III 1994; 317: 351—357.

26.Vainzhof M., Richard P., Hermann R. et al. Prenatal diagnosis of laminin alpha2 chain (merosin)-deficient congenital muscular dystrophy: a collective experience if five international centers. Neuromuscul Disord 2005; 15: 588—594.

27.Vigliano P., Dassi P., Blasi C. et al. LAMA2 stop-codon mutation: merosindeficient congenital muscular dystrophy with occipital polymicrogyria, epilepsy and psychomotor regression. Eur J Paediat Neurol 2009; 13: 72—76.

28.Washington University Neuromuscular Disease Database: http://neuromuscular.wustl.edu

29.Xiong H., Yao S., Yuan Y. et al. Diagnosis of congenital muscular dystrophy and clinical significance of merosin expression. Zhonghua Er Ke Za Zhl 2006; 44: 918—923.

30.Yuan J., Takashima H., Higuchi I. et al. Genetically confirmed patients with merosin-deficient congenital muscular dystrophy in China. Neuropediatrics 2008; 39: 264—267.