Журнал неврологии и психиатрии / 2007 / NEV_2007_10_09

Артериальные аневризмы сосудов головного мозга являются главной причиной спонтанных субарахноидальных кровоизлияний, приводящих к инвалидизации и гибели пациентов в трудоспособном возрасте [5]. Во всем мире проводится активный поиск генов-кандидатов развития аневризм сосудов головного мозга и выявление ассоциаций полиморфных вариантов ряда генов с аневризмами. Одним из направлений является исследование генов, участвующих в процессах регуляции сосудистого тонуса. Наиболее важными в этом плане являются гены ангио-

© Коллектив авторов, 2007

Zh Nevrol Psikhiatr Im SS Korsakova 2007;107:10:52—57

тензинпревращающего фермента (АПФ, или АСЕ, — angiotensin-convering enzyme) и белка аполипопротеина Е (АРОЕ), полиморфные варианты которых ассоциированы с артериальной гипертензией (АГ) [1—3, 10, 12, 13, 18, 19, 22], играющей важную роль в патогенезе аневризм и повышающей риск развития САК приблизительно в 2,5 раза [5].

Задачей настоящего исследования было выявление генетической предрасположенности к аневризмам сосудов головного мозга на основе изучения Alu- инсерционного полиморфизма в гене ангиотензинпревращающего фермента и полиморфизма, обусловленного точковыми нуклеотидными заменами, приводящими к замещениям цистеина и аргинина в положениях 112 и 158 полипептидной цепи белка аполипопротеина Е у больных и в контрольной группе здоровых индивидов.

Материал и методы

Материалом для исследования послужили образцы ДНК, выделенной из крови 166 больных с интракраниальными аневризмами (ИА) мозговых сосудов, оперированных в межобластном нейрохирургическом центре им. Д.Г. Шефера, и ДНК 192 практически здоровых лиц контроля, принадлежащих к русской этнической группе (табл. 1). Данное исследование было одобрено заседанием этического комитета Уральской государственной медицинской академии (от 24.05.04).

Выделение ДНК из цельной крови проводилось методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции [9]. Генотипирование образцов проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе Терцик производства компании «ДНК-технология» с использованием ДНКполимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс» и праймеров, описанных ранее [15, 23]. Продукты амплификации локуса АроЕ подвергали ферментативному гидролизу с использованием рестриктазы Hinf6I: к 20 мкл амплификата добавляли 5 ед. активности рестриктазы и инкубировали при 37°С в течение 10 ч.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistica (ver. 6.0) [20]. При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля применялся критерий χ2 для таблиц сопряженности 2½2, а также критерий χ2 с поправкой Йейтса когда число наблюдений хотя бы в одном случае было менее 6. В случае наличия достоверных отличий в исследуемых выборках проводилась оценка показателя отношения шансов (ОШ), а также границ его 95% доверительного интервала (95% ДИ). Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя ОШ, по формуле ОШ=(a½d)/ (b½c), где а — число лиц с наличием, b — с отсутствием данного генотипа среди больных; c и d — число лиц соответственно с наличием и отсутствием данного генотипа в контрольной группе.

Результаты

Исследование полиморфных вариантов гена АРОЕ

Результаты проведенного анализа показали нали- чие трех аллельных вариантов (ε2, ε3, ε4) и 6 геноти-

Таблица 1. Основные характеристики больных аневризмами и контроля при проведении генетических исследований

ГЕНЕТИКА ИНТРАКРАНИАЛЬНЫХ АНЕВРИЗМ

пов (ε2/ε2, ε2/ε3, ε2/ε4, ε3/ε3, ε3/ε4 и ε4/ε4) исследуемого локуса гена АРОЕ. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов АРОЕ гена между исследуемой общей выборкой больных и контрольной группой не выявил достоверных различий. По частоте в обеих группах преобладал аллель ε3 и генотип ε3/ε3 (табл. 2 и 3). При разделении выборок больных и контроля по полу выявлена тенденция к более высокой частоте аллеля ε2 у женщин с аневризмами по сравнению с соответствующей контрольной группой, однако различия не достигли достоверных различий (χ2=3,12; р=0,074). Группа женщин с аневризмами при наличии АГ достоверно отличается от контрольной группы более высокой частотой аллеля ε2 (χ=6,29; p=0,0121) и тенденцией к более высокой частоте генотипа ε2/ε3 (χ2=3,47; p=0,0625). Если рассматривать выборки женщин с семейными слу- чаями артериальной гипертензии (наличие АГ у коголибо из родственников первой степени родства), различия в частоте генотипа ε2/ε3 по сравнению с контрольной группой (без семейных случаев АГ) достигают статистически достоверных значений (χ2=4,58; р=0,032). У мужчин с аневризмами и артериальной гипертензией подобных закономерностей распределения частот аллелей и генотипов исследуемого локуса гена АРОЕ не обнаружено. При этом в группе мужчин с семейными случаями артериальной гипертензии аллель ε4 является протективным (χ2=8,23; p=0,0141; ОШ=0,201 (95% ДИ=0,069—0,591)). Полу- ченные результаты свидетельствуют о существовании половых различий в генетических факторах риска развития аневризм. При выделении из общей выборки больных с ИА тех, кто имел АГ у обоих родителей, также были получены достоверно значимые различия в частоте аллеля ε2 и генотипа ε2/ ε3 в сравнении с контролем без случаев АГ у обоих родителей (χ2=5,87; ð=0,025 è χ2=9,08; р=0,005 соответственно). Кроме того, была обнаружена ассоциация аллеля ε2

èгенотипа ε2/ε3 с наличием инсультов (как геморрагических, так и ишемических) у родственников пер-

вой степени родства (PIстР) больных с аневризмами (χ2=5,59; p=0,025 è χ2=7,13; p=0,01 соответственно). При выделении из этой выборки больных тех, у родственников которых было документальное подтвер-

ждение наличия внутричерепного кровоизлияния, была выявлена ассоциация аллеля ε2 и генотипа ε2/ ε3 с наличием кровоизлияний у PIстР (χ2=5,34; ð=0,025

èχ2=5,82; p=0,025 соответственно). Была также обнаружена aассоциация аллеля ε2 и генотипа ε2/ε3 с семейными случаями аневризм у РIстР (χ2=7,37; ð=0,01

èχ2=9,88; р=0,005 соответственно).

Исследование полиморфных вариантов гена ACE

Распределение частот аллелей и генотипов Aluинсерционного полиморфизма гена АСЕ у больных аневризмами артериальных сосудов головного мозга и в контрольной группе представлено в табл. 4. При исследовании общих выборок больных и контроля не обнаружено статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов исследуемого локуса. Частота аллеля *1 (0,536) и гетерозиготного генотипа *I*D (0,523) преобладала в обеих исследованных группах.

АРОЕ с плохими исходами после аневризматического субарахноидального кровоизлияния [11]. Учитывая, что во многих исследованиях по изучению факторов риска для ИА и кровоизлияний отмечено то, что гипохолестеринемия может быть фактором риска развития кровоизлияний [5] и что у носителей изоформы 2 снижено сродство к рецепторам аполипопротеинов В и Е [22] и уровень холестерина у них может быть более низким [4], можно предположить, что существует генетическая взаимосвязь всех этих факторов у носителей аллеля ε2 и генотипа ε2/ε3 АРОЕ гена у больных с аневризматическими кровоизлияниями. Все это свидетельствует, что носительство аллеля ε2 и генотипа ε2/ε3 АРОЕ может представлять риск для развития аневризм и ген АРОЕ может быть одним из генов-кандидатов, вовлеченных в процесс аневризмогенеза.

Ãåí ÀÑÅ

При анализе распределения частот генотипов у мужчин и женщин при наличии артериальной гипертензии обнаружены достоверные различия в распределении частот генотипов у мужчин с АГ и контрольной группы без АГ. При этом генотип *I*D оказался протективным, а генотип *D*D— рисковым.

Для сравнения данных нашего исследования с изучением гена АСЕ у больных с аневризмами мы просмотрели все относящиеся публикации, используя систему MEDLINE в Интернете. K. Takenaka и соавт. [21] не выявили ассоциации АГ с генотипами или аллелями АСЕ гена у больных с аневризмами. В США изучался полиморфизм АСЕ гена у больных с ИА, но не сравнивались группы больных с ИА в зависимости от наличия АГ, и ассоциаций АСЕ гена с аневризмами не выявлено [14]. Других подобных исследований мы не встретили. Большинство проведенных исследований [8, 17] касалось изучения АСЕ у больных с разорвавшимися аневризмами.

Мы сопоставили наши результаты с данными других авторов, исследовавших связь АСЕ с гипертензией. Многие исследования [1—3] продемонстрировали наличие ассоциации между DD генотипом гена АСE

и гипертензией. Но возникает вопрос, почему в нашем исследовании, несмотря на то, что гипертензия преобладала у женщин, а не у мужчин, DD генотип был ассоциирован с наличием гипертензии у мужчин с аневризмами? В литературе имеется несколько публикаций о наличии половых различий в частоте генотипа DD у больных с гипертензией. Согласно проведенному исследованию «Framingham heart study» (3145 человек), имеется ассоциация I/D полиморфизма гена АСЕ с эсенциальной гипертензией и уровнем диастолического артериального давления у мужчин, но не у женщин [12]. Данные об ассоциации DD генотипа с гипертензией у мужчин получены также и другими авторами [7, 13, 19]. С чем это может быть связано? М. Fornage и соавт. [6] показали, что имеется генетическое различие в регионе АСЕ гена, которое значительно влияет на индивидуальные различия в уровне кровяного давления у мужчин, а не у женщин. В исследовании, проведенном A. Schut и соавт. [16], показано влияние курения на развитие гипертензии у людей-носителей аллели D. Авторы полагают, что курение и носительство аллели D оказывают непосредственное влияние на развитие гипертонии. Учи- тывая, что 83,1% (69 из 83) мужчин в нашем исследовании были курильщиками, можно предположить, что курение в сочетании с DD генотипом АСЕ способствовало развитию артериальной гипертензии у мужчин, а не у женщин, среди которых курильщиками были всего 21,7%. Среди носителей DD генотипа мужчины-курильщики с АГ встречались в 2,2 раза чаще, чем женщины-курильщики. Это, а также, повидимому, существующее генетическое различие в регионе генa АСЕ, влияющее на индивидуальные различия в уровне кровяного давления у мужчин, а не у женщин, объясняет выявленную в нашем исследовании ассоциацию DD генотипа гена АСЕ с наличием гипертензии у мужчин с аневризмами. Учитывая, что частота DD генотипа у мужчин с ИА и АГ была более чем в 2 раза выше, чем в контрольной группе, мы считаем, что существует тенденция к увеличению риска развития аневризм у мужчин-носителей DD генотипа с гипертензией.

Таким образом, аллель ε2 и генотип ε2/ε3 АРОЕ гена являются рисковыми для развития аневризм сосудов головного мозга у женщин с артериальной гипертензией и семейной отягощенностью по гипер-

ГЕНЕТИКА ИНТРАКРАНИАЛЬНЫХ АНЕВРИЗМ

тензии, а также у больных с семейным анамнезом аневризм, кровоизлияний и инсультов. DD генотип гена АСЕ является рисковым для развития аневризм у мужчин с артериальной гипертензией.

ЛИТЕРАТУРА

1.Мустафина О.Е., Туктарова И.А., Бикмеева A.M. и др. Исследование инсерционно-делеционного полиморфизма ангиотензинпревращающего фермента в популяциях Волго-Уральского региона. Генетика 2001; 37: 3: 426—430.

2.Barbalic M., Skaric-Juric T., Cambien F. et al. Gene polymorphisms of the renin-angiotensin system and early development of hypertension. Am J Hypertens 2006; 19: 8: 837—842.

3.Bengtsson K., Orho-Melander M., Lindblad U. et al. Polymorphism in the angiotensin converting enzyme but not in the angiotensinogen gene is associated with hypertension and type 2 diabetes: the Skaraborg Hypertension and diabetes project. J Hypertens 1999; 17: 11: 1569—1575.

4.De Knijff P., van den Maagdenberg A., Frants R. et al. Genetic heterogeneity of apolipoprotein E and its influence on plasma lipid and lipoprotein levels.Hum Mutat 1994; 4: 178—194.

5. Feigin V.L., Rinkel G.J., Lawes C.M. et al. Risk factors for subarachnoid hemorrhage: an updated systematic review of epidemiological studies. Stroke 2005; 36: 12: 2773—2780.

6.Fornage M., Amos C.I., Kardia S. et al. Variation in the region of the angiotensin-converting enzyme gene influences interindividual differences in blood pressure levels in young white males. Circulation 1998; 97: 18: 1773—1779.

7.Kazama I., Satoh T., Hashimoto J. et al. Angiotensin-converting enzyme I/D polymorphism and hypertension: the Ohasama study. J Hypertens 2002; 20: 6: 1121—1126.

8.Keramatipour M., McConnell R.S., Kirkpatrick P. et al. The ACE I allele is associated with increased risk for ruptured intracranial aneurysms. J Med Genet 2000; 37: 7: 498—500.

9. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA. In: J.M.Walker (ed.). Methods in molecular biology. New York: Haman Press 1984; 31—34.

10.Matsubara M., Suzuki M., Fujiwara T. et al. Angiotensin-converting enzyme I/D polymorphism and hypertension: the Ohasama study. J Hypertens 2002; 20: 6: 1121—1126.

11.Niskakangas T.,Ohman J.,Niemela M. et al. Association of apolipoprotein E polymorphism with outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a preliminary study. Stroke 2001; 32: 5: 1181— 1184.

12.O’Donnell Ñ.J., Lindpaintner K., Larson M.G. et al. Evidence for association and genetic linkage of the angiotensin-converting enzyme

locus with hypertension and blood pressure in men but not women in the Framingham Heart Study. Circulation 1998; 97: 18: 1766— 1772.

13.Oren I., Brook J.G., Gershoni-Baruch R. et al. The D allele of the angiotensin-converting enzyme gene contributes towards blood LDLcholesterol levels and the presence of hypertension. Atherosclerosis 1999; 145: 2: 267—271.

14.Pannu H., Kim D.H., Seaman C.R. et al. Lack of an association between the angiotensin-converting enzyme insertion/deletion polymorphism and intracranial aneurysms in a Caucasian population in the United States. J Neurosurg 2005; 103: l: 92—96.

15.Rigat Â., Hubert C., Corvol P., Soubrier F. PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene (PCP1) (dipeptidyl carboxypeptidase 1). Nuc Acids Res 1992; 6: 539—545.

16.Schut A.F., Sayed-Tabatabaei F.A., Witteman J.C. et al. Smokingdependent effects of the angiotensin-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism on blood pressure. J Hypertens 2004;

22:2: 313—319.

17.Slowik A., Borratynska A., Pera J. et al. II genotype of the angio- tensin-converting enzyme gene increases the risk for subarachnoid hemorrhage from ruptured aneurysm. Stroke 2004; 35: 7: 1594— 1597.

18.Staessen J.A., Wang J.G., Ginocchio G. et al. The deletion/insertion polymorphism of the angiotensin converting enzyme gene and car- diovascular-renal risk. J Hypertens 1997; 15: 12 Pt 2: 1579—1592.

19.Stankovic A., Zivkovic M., Alavantic D. Angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism in a Serbian population: a gender-specific association with hypertension. Scand J Clin Lab Invest 2002; 62: 6: 469—475.

20. StatSoft, Inc. STATISTICA for Windows (Computer program manual). Tulsa, OK: StatSoft, Inc., 1999. WEB: http://www.statsoft.com.

21.Takenaka K., Yamakawa H., Sakai H. et al. Angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism in intracranial saccular aneurysm individuals. Neurol Res 1998; 20: 7: 607—611.

22.Um J.Y., Hwang C.Y., Hwang W.J. et al. Association between iris constitution and apolipoprotein e gene polymorphism in hypertensives. J Altera Complement Med 2004; 10: 6: 1101—1105.

23.Wenham P.R.,Price W.H.,Blundell G. Apolipoprotein E genotyping using one stage PCR. Lancet 1991; 337: 1158—1159.