МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА № 12

ТЕМА: Иммунитет и естественная резистентность организма к инфекции. Оценка общего реактивного потенциала организма. Факторы резистентности, методы их выявления. Специфический иммунитет

МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА:Иммунитет и естественная резистентность организма к инфекции нуждается в детальном и поэтапном изучении. Поэтому, важное значение имеют материальная основа и функции защитных систем.

Естественная резистентность организма во многом определяется состоянием его различных анатомо-физиологических механизмов и находится в тесном взаимодействии с высоко специализированной иммунобиологической системой. Она является первой, а в некоторых случаях единственной, линией обороны от инфекции, в единстве с иммунной системой определяет напряженность сопротивление ей инфекции. Иммунитет - это комплексная система защитных реакций, но первой принимает на себя атаку возбудителей естественная резистентность и её факторы. От неё зависит начало заболевания.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ:

Общая: дать представление о видах иммунитета, системе естественной резистентности организма к инфекции, её механизмах.

Конкретная:научить определению факторов неспецифической защиты организма от инфекции

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ И ВВОДНОГО КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ

1.Виды иммунитета макроорганизма к возбудителям инфекционных заболеваний, их классификация: врождённый и приобретённый, естественный и искусственный, активный и пассивный иммунитет, стерильный и нестерильный.

2. Видовой иммунитет и его варианты: абсолютный, относительный, временный (иммунитет новорождённых).

3. Классификация факторов естественной резистентности к инфекциям.

4. Физиологический (барьерная функция покровов, антимикробное действие секретов, выделительная система, антагонистическое действие нормальной микрофлоры, адсорбционная функция тканей, фагоцитоз, антимикробные факторы, лизоцим, бета лизины, комплемент и др.) и патофизиологические (стресс) механизмы неспецифической резистентности.

5. Фагоцитоз. Макро- и микрофаги, их функциональные отличия. Механизмы, определение, этапы фагоцитоза, его оценка (показатели). Завершённый и незавершённый фагоцитоз.

6. Комплементарная система, её состав. Классический и альтернативный пути её активации, функции, определение.

7. Бета-лизины и общая бактерицидность, назначение, определение.

8. Лизоцим, его продукция, действие, определение.

9. Интерферон, его продуценты, функции, определение.

10. Роль персистенции микробов в регуляции защиты от инфекции, факторы, их определение.

11. Значение неспецифической резистентности в подготовке специфической иммунной защиты организма (переработка антигенной информации микробов) и её презентация.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ С ПОЛНЫМ РЕГЛАМЕНТОМ ПРОТОКОЛА ЗАНЯТИЯ

№	Наименование учебного элемента (задания)	Методическое решение	Регламент протокола
1.	Составить классификацию видов иммунитета	Рекомендуемая литература	Записать в протокол
2.	Составить классификацию факторов естественной резистентности	Рекомендуемая литература	Записать в протокол
3.	Поставить опыт фагоцитоза и определить ФП, ФЧ, ОФИ, составить схему оценки завершённости фагоцитоза	Приложение 1	Записать в протокол
4.	Изучить технику постановки реакций по определению титра лизоцима, комплемента, бета-лизинов, общей бактерицидности и пути активации комплемента	Приложение 6	Заполнить таблицу и записать в протокол
5.	Используя демонстрационный материал, установить титр всех факторов	Приложение 2, 3, 4, 5	Записать в протокол
6.	Тестовый контроль по теме	Приложение 7

Приложение 1 опыт фагоцитоза

/по Алексеевой О.Г., Волковой А.П., 1966/

К 0,1 мл З % стерильного раствора антикоагулянта лимоннокислого натрия добавить 0.2 мл крови больного и 0,1 мл 2 млрд взвеси суточной культуры золотистого стафилококка (S.aureus№209P). Смесь тщательно перемешать и инкубировать при 37 С⁰ 30-40 минут. Из кровяно-микробной взвеси приготовить мазок, высушить на воздухе, зафиксировать, окрасить по Романовскому-Гимза в модификации Филипсона: на высохший препарат нанести 11 капель спиртового раствора краски Романовского (1 часть краски и З части этилового спирта), окрашивать до 30 минут, затем препарат тщательно промыть водой, высушить. Микроскопировать с иммерсией.

В мазке следует определить:

1. Интенсивность фагоцитоза — процент фагоцитирующих лейкоцитов в общей их массе (фагоцитарный показатель - ФП).

2. Фагоцитарное число — ФЧ (среднее число поглощённых микробных клеток в одном фагоците).

3. Опсонофагоцитарный индекс по формуле:

ОФИ должен быть больше единицы, что говорит о накоплении антител — опсонинов, помощников фагоцитов.

4. ОФИ можно оценить также по уровню и динамике ФЧ по таблице:

Таблица 1

Определение опсонофагоцитарного показателя по методу и таблице Шриттер — Мурсаловой

Количество микробов, фагоцитированных одним фагоцитом (ФИ)	Оценка фагоцитоза по выраженности	Количество нейтрофилов с таким фагоцитозом	ОФИ
0 1-20 21-40 41 и более	0 + /1/ ++ /2/ +++ /3/	0 10 10 5	0 10 20 15
ИТОГО: 25 45

ОФИ, равный 10-24, характеризует слабоположительную реакцию, 25-49 — ясно выраженную, 50-75 резко положительную.

Кроме того, в отношении ОФИ по отношению к возбудителям некоторых инфекций (например, к бруцеллам) есть специальная оценочная шкала

5. а) Оценка завершённости фагоцитарной реакции по индексу завершённости.

Кровяно — микробную взвесь инкубируют при +37Сº 2 часа. После этого из неё готовят мазок, высушивают и отдельно не фиксируют, окрашивают сначала раствором прочного зелёного 20 минут и докрашивают 0,1 % водным раствором азура П.

При этом жизнеспособные клетки окрашиваются в сине-сиреневый цвет.

Определяют ИЗФ – индекс завершённости фагоцитоза рассчитывается по формуле:

.

ИЗФ = Е 30 мин, где

Е 2 часа

Е 30 мин. – общее количество микробных клеток в 100 фагоцитах через 30 минут;

Е 2 часа – общее количество микробных клеток в 100 фагоцитах через 2 часа, то есть после окончания фагоцитоза.

Завершённым должен быть фагоцитоз с не менее 2/3 фагоцитов (~60 % и >).

б) Оценка завершенности фагоцитоза ускоренным методом Мотавкиной Н.С.,

Ховриной М.П. (1962).

Она осуществляется сразу после окончания опыта путем обработки микробо-кровяной (лейкоцитарной) взвеси раствором флюорохрома - акридина оранжевого 1:1000. Мёртвые особи под люминисцентным микроскопом оранжево-жёлтые, живые – зелёные. Расчёт завершённости делают по проценту фагоцитов с поглощёнными микроробами.

Приложение 2

а) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ЛИЗОЦИМА КЛАССИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

По лизису индикаторной культуры чувствительного микрококка M. lysodeikticus

Ингредиенты	Разведения сыворотки, слюны
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	К. к.
Физиологический 0,85% раствор поваренной соли	1	1	1	1	1	1	1	1
Субстрат (сыворотка) испытуемый	1	1	1	1	1	1	1	1 до 1 % р-р
Тест-культура микрококка (1 млрд мт в 1мл) в каплях	2 к.	2 к.	2 к.	2 к.	2 к.	2 к.	2 к.	2 к.
Инкубировать 3 часа при +37С°
Учет результатов	Лизис тест-культуры			Отсутствие лизиса

Титр лизоцима в исследуемом субстрате равен 1:40 (максимальное разведение, или минимальное количество,давшее лизис культуры и просветление).

б) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ЛИЗОЦИМА МИКРОМЕТОДОМ

по Н.С. Мотавкиной, Б.М. Ковалеву, А.С. Шаронову (1979)

В камеру, состоящую из 2 фотопластин и ограничивающей прокладки между ними, внести смесь расплавленной и остуженной до +45С° 2% агарозы икультуры микрококка в концентрации 500 тыс. мт/мл. После застывания агаровогосубстрата, верхнюю пластинку снимают скользящим движением и с помощью пробойника делают лунки, вносят в одну из них испытуемое вещество, в другую - раствор кристаллического лизоцима. Последний служит контролем и вносится в разных концентрациях в равных объемах. Инкубировать 3 часа при +37С° во влажной камере.

По лизису тест-микроба в присутствии кристаллического лизоцима в контроле строится график зависимости диаметра зоны лизиса от концентрации этого вещества. Диаметр лизиса опытных проб сопоставляют с показателями графика и определяют в них активность (титр) лизоцима.

Приложение 3