Выявление капсул у бактерий методом бурри – гинса

Техника окраски:

1. Черную тушь смешивают с культурой, делают мазок препарата, как мазок крови и высушивают препарат.

2. После этого проводят фиксацию препарата химическим способом: смесью Никифорова или другими смесями.

3. Промывают водой.

4. Окрашивают тела микробных клеток карболовым фуксином Циля, разведенным 1:3, в течение 3-5 минут.

5. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Оценка результата.На темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, внутри которых находятся тела бактерий красного/ярко-малинового цвета.

Приложение 7

Выявление спор у бактерии методом ожешко

Техника окраски:

1. На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной кислоты (HCl) и подогревают 1 - 2 мин над пламенем горелки/спиртовки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.

2. Препарат (остывший) промывают водой, подсушивают и фиксируют над пламенем горелки/спиртовки.

3. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании до появления паров.

4. Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение нескольких секунд.

5. Промывают водой.

6. Докрашивают 3 - 5 мин метиленовым синим Леффлера (дополнительный краситель), высушивают и микроскопируют с иммерсией.

Оценка результатов. Споры бактерий окрашиваются в красный цвет, цитоплазма приобретает синий цвет, вегетативные тела микробных клеток – голубого цвета.

Приложение 8

Выявление жгутиков у культуры подвижных микроорганизмов методом серебрения по морозову:

Техника окраски:

1. Прокаленной и охлажденной петлей слегка прикасаются к поверхности колоний или газонного роста микробной культуры, чтобы не вызвать механического повреждения жгутиков.

2. Полученный материал переносят в преципитационную пробирку, на дно которой налито 0,1 - 0,2 мл 1% раствора формалина. Петлю оставляют в неподвижном состоянии на несколько минут. За это время часть микробов переходит с петли в раствор. Эту процедуру повторяют 2-3 раза, пока жидкость не станет слабо опалесцировать.

3. Приготовленную взвесь ставят на 1 - 2 ч в термостат при 37⁰С для равномерного распределения микроорганизмов в жидкой среде.

4. Затем в пробирку с 1,5 - 2 мл дистиллированной воды вносят 1-2 капли формалиновой бактериальной взвеси. Через 10-15 мин, после того как бактерии относительно равномерно распределятся по всему объему жидкости, наносят 5-6 капель полученной взвеси на предметное стекло, не касаясь его петлей.

5. Капли высушивают на воздухе, не размазывая.

6. Для лучшего протравливания обрабатывают их реактивом № 1 (Реактив № 1:1 мл ледяной уксусной кислоты. 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды) в течение 1 мин.

7. Остатки протравы сливают, мазок промывают водой.

8. После подсыхания мазка на препарат наливают реактив № 2 (Реактив № 2: 5 г танина, 1 мл жидкой карболовой кислоты, 100 мл дистиллированной воды), подогревают на лёгком пламени до появления паров (1 мин).

9. Тщательно промывают водой (1-2 мин).

10) На подсушенный после промывания препарат наносят реактив № 3 (Реактив № 3: 5 г кристаллического нитрата серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой сосуд, к оставшимся 80 мл раствора серебра по каплям добавляют раствор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется лёгкая опалесценция. Если аммиака будет слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо по каплям добавлять до получения нужной слабой опалесценции) и выдерживают его до появления тёмно- коричневой окраски мазка.

11) Тщательно промывают водой.

12) Высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Оценка результатов. Тела микробных клеток окрашиваются в коричневато-чёрный (угольно-черный) цвет, жгутики приобретают различные оттенки коричневого цвета и отчетливо видны на окрашенном в слабо-желтый цвет фоне.

Приложение 9