Ориентировочная основа деятельности студентов (оод) для проведения лабораторной работы:

Работа № 1 Очистка белковых растворов – диализ

Принцип метода. Диализ – это процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент, почечные фильтры капсулы Боумена - Шумлянского). Обладая большим диаметром и молекулярной массой, белковые молекулы не способны проникать через мелкие поры, в то время как низкомолекулярные вещества и ионы легко диффундируют через мембраны в окружающую среду.

Порядок выполнения работы: в целлофановый мешочек (диализатор) наливают на 1/3 объема раствор яичного белка, содержащий Nacl (диализируемая жидкость). Диализатор подвешивают на стеклянных палочках и погружают в стакан с дистиллированной водой (диализат). Через 1 час от начала диализа с небольшими порциями диализата и диализируемой жидкости, отобранными с помощью пипетки, проводят пробы на Nacl (хлориды) и белок.

Проба на хлориды: 10 капель исследуемой жидкости + 1 капля 10% раствора HNO₃ + 1% раствора AgNO₃ → наблюдается образование белого творожистого осадка

Проба на белок (биуретовая реакция)

10 капель исследуемой жидкости + 5 капель 10% раствора NaOH + 1 капля 1% раствора CuSO₄ → при наличии белка в растворе проба дает фиолетовое окрашивание, при отсутствии - голубое

Отметить результаты на белок и хлориды с содержимым диализатора и наружной жидкостью. В выводе указать, почему белки не диффундируют через полупроницаемые мембраны.

Клинико-диагностическое значение. Особый вид диализа (гемодиализ) применяется в клинике для очистки крови с целью удаления из нее низкомолекулярных токсических веществ (аппарат «искусственная почка»)

Работа № 2 Реакции обратимого осаждения белков - высаливание

Принцип метода. Высаливание – обратимая реакция осаждения белков из растворов с помощью больших концентраций нейтральных солей: Nacl, (NH₄)₂SO₄ и др. При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка. На процесс высаливания влияет ряд факторов: молекулярная масса, заряд, гидрофильность белка, в связи с чем, для осаждения требуется различная концентрация одних и тех же солей. Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, осаждаются в полунасыщенном растворе Nacl, а альбумины – в насыщенном. Высаливание белков является обратимой реакцией, т.к. осадок белка может вновь растворяться после удаления Nacl, например, с помощью диализа.

Порядок выполнения работы:

1). К 40 каплям раствора яичного белка добавляем Nacl (кристаллический) до полунасыщения → выпадает белый аморфный осадок глобулинов.

Через 10 минут (время полного осаждения глобулинов) осадок отфильтровывают.

2). Пробирку с фильтратом, содержащим альбумин, кипятят несколько минут. Наблюдается необратимое осаждение альбуминов, вызванное денатурацией белка и потерей растворимости. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают.

3). С конечным фильтратом проделывают биуретовую реакцию (см. Диализ). В отсутствии белка в фильтрате убеждаются по отрицательным результатам биуретовой реакции. Для сравнения проделать биуретовую реакцию с исходным раствором яичного белка. Отметить результаты биуретовой реакции. В выводах указать, какая из белковых фракций легче осаждается и причины этого явления.

Клинико-диагностическое значение. Метод используется для фракционирования белков (разделения белков по фракциям), что позволяет использовать отдельные белковые фракции крови с лечебными целями (альбумин, γ-глобулины, фибриноген плазмы крови и др.)

Работа № 3 Реакции необратимого осаждения белков солями тяжелых металлов

Принцип метода. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (медь, железо, свинец, ртуть и др.) денатурируют и образуют нерастворимые в воде комплексные соединения, которые выпадают в осадок. Возникновение нерастворимых в воде комплексов обусловлено адсорбцией ионов металла на поверхности белковой молекулы. В избытке солей образовавшиеся осадки растворяются, что связано с адсорбцией тяжелого металла на поверхности коллоидных частиц и появлением положительного заряда на молекуле белка (адсорбционная пептизация, исключение – соли AgNO₃ и Hgcl₂).

Порядок выполнения работы:

1. В три пробирки наливают по 10 капель раствора яичного белка

2. В пробирку №1 добавляют 1-2 капли 5% раствора CuSO₄

3. В пробирку №2 добавляют 1-2 капли 5% раствора Pb(CH₃COO)₂

4. В пробирку №3 добавляют 1-2 капли 1% раствора AgNO₃

Выпадает осадок белка во всех трех пробирках.

5) В каждую из трех пробирок добавляют избыток реактива.

В пробирке №1 и №2 может наблюдаться эффект растворения осадка

Клинико-диагностическое значение. Тяжелые металлы в высоких дозах оказывают токсическое действие (неблагоприятный экологический фактор).

На способности белков образовывать нерастворимые осадки с солями тяжелых металлов основывается использование белков в качестве антидотов (противоядий) при пероральном отравлении тяжелыми металлами. Сразу после отравления обычно применяют белки молока или яиц, пока соли находятся в желудке и не успели всосаться. Вслед за дачей белка у больного вызывают рвоту, чтобы удалить токсичные металлы из организма.

Работа № 4 Определение белка в моче методом осаждения

Принцип метода. Белки при взаимодействии с концентрированными минеральными кислотами денатурируют и выпадают в осадок.

Для обнаружения белка в моче применяют реакции необратимого осаждения с помощью азотной и сульфосалициловой кислот (последняя – самая чувствительная).

Порядок выполнения работы: К 1 мл мочи приливают 3 капли 20% сульфосалициловой кислоты. При наличии белка в моче образуется белый осадок (или помутнение), интенсивность которого зависит от концентрации белка в моче. Все реакции на патологические компоненты мочи выполняются студентами одновременно с исследованием нормальной мочи. В выводах указать возможную причину появления белка в моче.

Клинико-диагностическое значение. Белок в нормальной моче находится в виде следов, которые не открываются обычными реакциями, применяемыми в клинической лаборатории. При ряде заболеваний с мочой начинает выделяться заметное количество белка, начиная с долей грамма до 25 г/сутки. Появление белка в моче называется протеинурией или альбуминурией, поскольку моча содержит, в основном, сывороточный альбумин и лишь частично сывороточный глобулин. Белок появляется в моче при нефрите (воспалении сосудистых клубочков почек, что приводит к увеличению их проницаемости); в случае сердечной декомпенсации; при некоторых формах повышенного артериального давления; иногда при беременности; при приеме некоторых лекарственных препаратов и др.

Задания для контроля уровня сформированности компетенций в учебное время:

1. Каковы современные методы фракционирования (разделения) белков?

2. Каковы современные методы определения молекулярной массы белков?

3. Объясните, какими методами можно осадить белки без потери ими нативных свойств?

4. Какое значение имеют реакции обратимого осаждения белков для медицины и фармации?

5. С помощью, каких методов можно удалить низкомолекулярные примеси из растворов белка?

6. Приведите доказательства обратимости высаливания белков.

7. Поясните, как влияет рН среды (ацидоз, алкалоз) на заряд белковой молекулы.

8. Почему соли тяжелых металлов вызывают денатурацию белка?

9. С чем связано использование белков в качестве антидотов при отравлении солями тяжелых металлов?

10. Какие методы могут быть использованы для выявления протеинурии?