31
-гемы, входящие в состав цитохромов, каталазы, пероксидазы, гуанилатциклазы, NO-синтазы и являющиеся простетической группой ферментов; -нуклеотиды - доноры и акцепторы остатка фосфорной кислоты;
-убихинон, или кофермент Q, участвующий в переносе электронов и протонов в ЦПЭ; -фосфоаденозилфосфосульфат, участвующий в переносе сульфата; -S-аденозилметионин (SAM) - донор метильной группы;
-глутатион, участвующий в окислительно-восстановительных реакциях.
Строение и функции этих коферментов подробно рассмотрены в соответствующих разделах учебника. Водораствор витамины являются энзимовитаминами, то есть выполняют коферментные функции в составе ферментов. Проявления и механизмы гиповитаминозов по различным энзимовитаминам взаимосвязаны и перекрываются, хотя для большинства из них описаны и специфические авитаминозы.
Витамин В2, рибофлавин. входит в состав двух коферментов ФМН и ФАД, являющихся компонентами таких ферментов как сукцинатдегидрогеназа, дегидрогеназы жирных кислот, оксидаз аминокислот, МАО, цитохромредуктазы.Витамин В5, РР входит в состав коферментов НАД и НАДФ,которые являются коферментами более ста дегидрогеназ, участвующих в тканевом дыхании, окислении молочной, яблочной, кетоглутаровой, изолимонной кислот, фосфоглицеринового альдегида, жирных кислот и т.п.Витамин В6, пиридоксин Этот витамин в виде коферментов ПАЛФ (пиридоксальфосфата) и ПАМФ(пиридоксаминфосфата) входит в состав ферментов переаминирования, дезаминирования и декарбоксилирования аминокислот. В реакциях с участием пиридоксина, осуществляется всасывание и транспорт аминокислот, балансируется аминокислотный состав организма.Витамин Н, биотин служит коферментом карбоксилаз, таких как пируваткарбоксилаза, ацетил-КоА-карбоксилаза, пропионил-КоА-карбоксилаза. Биотин связывает молекулу углекислого газа и включает его в органическое вещество. Как кофермент витамин Н участвует т в синтезе жирных кислот, стеринов, пуриновых оснований, мочевины, превращении пиовиноградной кислоты в щавелевоуксусную кислоту.Витамин В3, пантотеновая кислота входит в состав кофермента ацетилирования (КоА), который активирует ацетат и ацильные группы, необходимые для синтеза жирных кислот, стеролов, ацетилхолина. Пантотеновая кислота участвует в биосинтезе жирных кислот
17. Ингибирование активности ферментов: обратимое (конкурентное и неконкурентное) и необратимое. Лекарственные препараты как ингибиторы ферментов.
Ингибирование ферментативной активности - снижение каталитической активности в присутствии определённых веществ - ингибиторов. К ингибиторам следует относить вещества, вызывающие снижение активности фермента. Следует отметить, что все денатурирующие агенты также вызывают уменьшение скорости любой ферментативной реакции, вследствие неспецифической денатурации белковой молекулы, поэтому денатурирующие агенты к ингибитррам не относят.
Ингибиторы вызывают большой интерес для выяснения механизмов ферментативного катализа, помогают установить роль отдельных ферментов в метаболических путях организма. В основе действия многих лекарственных препаратов и ядов лежит ингибирование активности ферментов, поэтому знание механизмов этого процесса крайне важно для молекулярной фармакологии и токсикологии.
Ингибиторы способны взаимодействовать с ферментами с разной степенью прочности. На основании этого различают обратимое и необратимое ингибирование. По механизму действия ингибиторы подразделяют на конкурентные и неконкурентные.
Обратимое ингибирование Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями и при
определённых условиях легко отделяются от фермента. Обратимые ингибиторы бывают конкурентными и неконкурентными.
1. Конкурентное ингибирование
К конкурентному ингибированию относят обратимое снижение скорости ферментативной реакции, вызванное ингибитором, связывающимся с активным центром фермента и препятствующим
32
образованию фермент-субстратного комплекса. Такой тип ингибирования наблюдают, когда ингибитор - структурный аналог субстрата, в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за место в активном центре фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ES) или фермент-ингибитор (EI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (EI) продукт реакции не образуется.
Для конкурентного типа ингибирования справедливы следующие уравнения:
Е + S ES → E + P,
E + I EI.
Классический пример конкурентного ингибирования - ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой. Малоновая кислота - структурный аналог сукцината (наличие двух карбоксильных групп) и может также взаимодействовать с активным центром сукци-нат дегидрогеназы. Однако отщепление двух атомов водорода от малоновой кислоты невозможно; следовательно, скорость реакции снижается.
Конкурентные ингибиторы уменьшают скорость химической реакции. Конкурентный ингибитор повышает Кm для данного субстрата (уменьшает сродство субстрата к ферменту). Это означает, что в присутствии конкурентного ингибитора необходима большая концентрация субстрата для достижения
1/2 Vmax.
Увеличение соотношения концентрации субстрата и ингибитора снижает степень ингибирования. При значительно более высоких концентрациях субстрата ингибирование полностью исчезает, потому что активные центры всех молекул фермента будут находиться преимущественно в комплексе с субстратом.
Четвертичные аммониевые основания ингибируют ацетилхолинэстеразу, катадизирующую реакцию гидролиза ацетилхолина на холин и уксусную кислоту (см. схему ниже)
При добавлении ингибиторов активность ацетилхолинэстеразы уменьшается, концентрация ацетилхолина (субстрата) увеличивается, что сопровождается усилением проведения нервного импульса. Ингибиторы холинэстеразы используют при лечении мышечных дистрофий. Эффективные антихолинэстеразные препараты - прозерин, эндрофоний и др.
2. Неконкурентное ингибирование
Неконкурентным называют ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра. Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата.
Неконкурентный ингибитор может связываться либо с ферментом, либо с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный комплекс. Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.
Кинетические зависимости
Этот тип ингибирования характеризуется снижением Vmax ферментативной реакции и уменьшением сродства субстрата к ферменту, т.е. увеличением Кm.
Необратимое ингибирование Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между
молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента, В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.
К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg2+), серебра (Ag+) и мышьяка (As3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению. При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается. В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.
18. Аллостерическая регуляция активности ферментов. Роль аллостерических ферментов в метаболизме клетки. Аллостерические эффекторы и ингибиторы. Особенности строения и
33
функционирования аллостерических ферментов и их локализация в метаболических путях. Регуляция активности ферментов по принципу отрицательной обратной связи.
Аллостерическими ферментами называют ферменты, активность которых регулируется не только количеством молекул субстрата, но и другими веществами, называемыми эффекторами. Участвующие в аллостерической регуляции эффекторы - клеточные метаболиты часто именно того пути, регуляцию которого они осуществляют.
Роль аллостерических ферментов в метаболизме клетки. Аллостерические ферменты играют важную роль в метаболизме, так как они чрезвычайно быстро реагируют на малейшие изменения внутреннего состояния клетки. Аллостерическая регуляция имеет большое значение в следующих ситуациях:
-при анаболических процессах. Ингибирование конечным продуктом метаболического пути и активация начальными метаболитами позволяют осуществлять регуляцию синтеза этих соединений; -при катаболических процессах. В случае накопления АТФ в клетке происходит ингибирование метаболических путей, обеспечивающих синтез энергии. Субстраты при этом расходуются на реакции запасания резервных питательных веществ; -для координации анаболических и катаболических путей. АТФ и АДФ - аллостерические эффекторы, действующие как антагонисты;
-для координации параллельно протекающих и взаимосвязанных метаболических путей (например, синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, используемых для синтеза нуклеиновых кислот). Таким образом, конечные продукты одного метаболического пути могут быть аллостерическими эффекторами другого метаболического пути.
Аллостерические эффекторы. Эффектор, вызывающий снижение (ингибирование) активности фермента, называют отрицательным эффектором, или ингибитором. Эффектор, вызьгоаюший повышение (активацию) активности ферментов, называют положительным эффектором, или активатором.
Аллостерическими эффекторами часто служат различные метаболиты. Конечные продукты метаболического пути - часто ингибиторы аллостерических ферментов, а исходные вещества - активаторы. Это так называемая гетеротропная регуляция. Такой вид аллостерической регуляции очень распространён в биологических системах.
Более редкий случай аллостерической регуляции, когда сам субстрат может выступать в качестве положительного эффектора. Такая регуляция называется гомотропной (эффектор и субстрат - одно и то же вещество). Эти ферменты имеют несколько центров связывания для субстрата, которые могут выполнять двойную функцию: каталитическую и регуляторную. Аллостерические ферменты такого типа используются в ситуации, когда субстрат накапливается в избытке и должен быстро преобразоваться в продукт.
Выявить ферменты с аллостерической регуляцией можно, изучая кинетику этих ферментов. Эти ферменты не подчиняются законам Михаэлиса-Ментен, они имеют характерную S-образную кривую зависимости скорости реакции от концентрации субстрата.
Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов:
-обычно это олигомерные белки, состоящие из нескольких протомеров или имеющие доменное строение; -они имеют аллостерический центр, пространственно удалённый от каталитического активного центра;
-эффекторы присоединяются к ферменту нековалентно в аллостерических (регуляторных) центрах; -аллостерические центры, так же, как и каталитические, могут проявлять различную специфичность по отношению к лигандам: она может быть абсолютной и групповой. Некоторые ферменты имеют несколько аллостерических центров, одни из которых специфичны к активаторам, другие - к ингибиторам.
-протомер, на котором находится аллостерический центр, - регуляторный протомер, в отличие от каталитического протомера, содержащего активный центр, в котором проходит химическая реакция; -аллостерические ферменты обладают свойством кооперативности: взаимодействие аллостерического эффектора с аллостерическим центром вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и
34
изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает каталитическую активность фермента; -регуляция аллостерических ферментов обратима: отсоединение эффектора от регуляторной
субъединицы восстанавливает исходную каталитическую активность фермента; -аллостерические ферменты катализируют ключевые реакции данного метаболического пути.
Локализация аллостерических ферментов в метаболическом пути. Скорость метаболических процессов зависит от концентрации веществ, использующихся и образующихся в данной цепи реакций. Такая регуляция представляется логичной, так как при накоплении конечного продукта он (конечный продукт) может действовать как аллостерический ингибитор фермента, катализирующего чаще всего начальный этап данного метаболического пути:
Фермент, катализирующий превращение субстрата А в продукт В, имеет аллостерический центр для отрицательного эффектора, которым служит конечный продукт метаболического пути F. Если концентрация F увеличивается (т.е. вещество F синтезируется быстрее, чем расходуется), ингибируется активность одного из начальных ферментов. Такую регуляцию называют отрицательной обратной связью, или ретроингибировани-ем. Отрицательная обратная связь - часто встречающийся механизм регуляции метаболизма в клетке.
В центральных метаболических путях исходные вещества могут быть активаторами ключевых ферментов метаболического пути. Как правило, при этом аллостерической активации подвергаются ферменты, катализирующие ключевые реакции заключительных этапов метаболического пути:
Каталитическая активность некоторых регуляторных ферментов может модулироваться низкомолекулярными аллостерическими эффекторами, обычно имеющими либо незначительное структурное сходство с субстратами или с коферментами регулируемого ими фермента, либо не имеющими его вообще. Ингибирование фермента, катализирующего одну из реакций в цепи, конечным продуктом этой цепи называют ингибированием по принципу обратной связи. В цепи реакций биосинтеза D из А, катализируемой ферментами
при высоких концентрациях D обычно наблюдается ингибирование превращения А в В. Это не простое «обращение» реакции, связанное с накоплением промежуточных продуктов, а следствие того, что продукт D способен связываться с ферментом выступая в качестве его ингибитора. Таким образом, D действует как отрицательный аллостерический эффектор фермента, или ингибитор, действующий по принципу обратной связи. Следовательно, ингибирование под действием D
35
регулирует синтез D. Обычно D связывается с ингибируемым ферментом в аллостерическом центре, удаленном от каталитического центра.
В кинетическом плане ингибирование по принципу обратной связи может быть конкурентным, неконкурентным, частично конкурентным и смешанным. Ингибирование по принципу обратной связи характерно для биосинтетических путей. Очень часто ингибитор, действующий по принципу обратной связи, является последней малой молекулой перед синтезом макромолекулы (например, аминокислотой, если речь идет о синтезе белков, или нуклеотидом в синтезе нуклеиновых кислот). Регуляция по принципу обратной связи обычно происходит на первой функционально необратимой стадии, уникальной для данной цепи реакций биосинтеза.
Примерами ингибирования по принципу обратной связи в микроорганизмах могут служить ингибирование фосфорибозил: АТР—пирофосфорилазы гистидином, антранилатсинтазы— триптофаном, аспартаттранскарбамоилазы — под действием СТР. В каждом случае регуляторный фермент участвует в цепи реакций биосинтеза единственного конечного продукта - His, Тrр или СТР.
Цепь реакций биосинтеза часто бывает разветвленной— ее первые реакции дают начало синтезу сразу двух или большего числа метаболитов. На рис. 10.4 указаны вероятные участки в разветвленной цепи биосинтеза, по которым осуществляется простое ингибирование по принципу обратной связи (ингибиторами могут служить аминокислоты, пурины или пиримидины). являются предшественниками всех четырех конечных продуктов - предшественником предшественником только D. Последовательности являются линейными и могут подвергаться ингибированию конечными продуктами по принципу обратной связи.
19. Регуляция каталитической активности ферментов ковалентной модификацией путем фосфорилирования и дефосфорилирования.
В биологических системах часто встречается механизм регуляции активности ферментов с помощью ковалентной модификации аминокислотных остатков. Быстрый и широко распространённый способ химической модификации ферментов - фосфорилирование/дефосфорилирование. Модификации подвергаются ОН-группы фермента. Фос-форилирование осуществляется ферментами протеинкиназами, а дефосфорилирование - фосфопротеинфосфатазами. Присоединение остатка фосфорной кислоты приводит к изменению конформации активного центра и его каталитической активности. При этом результат может быть двояким: одни ферменты при фосфорилировании активируются, другие, напротив, становятся менее активными.
Изменение активности фермента, вызванное фосфорилированием, обратимо. Отщепление остатка фосфорной кислоты осуществляется ферментами фосфопротеинфосфатазами. Активность протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз регулируется гормонами, что позволяет быстро изменять активность ключевых ферментов метаболических путей в зависимости от условий внешней среды. Антагонистичные по функции гормоны противоположным образом влияют на фосфорилирование/дефосфорилирование ферментов, вызывая противоположные эффекты изменения метаболизма клетки.
Например, под действием глюкагона (в период между приёмами пищи) в клетках происходит уменьшение синтеза энергетического материала - жира, гликогена и усиление его распада (мобилизация), вызванного фосфо-рилированием ключевых ферментов этих процессов. А под действием инсулина (во время пищеварения), наоборот, активируется синтез гликогена и ингибируется его распад, так как взаимодействие инсулина с рецептором активирует сигнальный путь,
36
приводящий |
к |
дефосфорилированию |
тех |
же |
ключевых |
ферментов. |
20. Ассоциация и диссоциация протомеров на примере протеинкиназы А и ограниченный протеолиз при активации протеолитических ферментов как способы регуляции протеолитической активности ферментов.
Протеинкиназы - группа ферментов, катализирующих перенос остатка фосфорной кислоты с АТФ на специфические ОН-группы аминокислотных остатков белков (вызывают фосфорилирование белков). Механизмы активации различных протеинкиназ неодинаковы. В качестве примера регуляции каталитической активности ферментов ассоциацией или диссоциацией протомеров можно привести регуляцию активности фермента Протеинкиназы А.
Протеинкиназа А (цАМФ-зависимая) состоит из 4 субъединиц 2 типов: 2 регуляторных (R) и 2 каталитических (С). Такой тетрамер не обладает каталитической активностью. Регуляторные субъединицы имеют участки связывания для циклического 3',5'-АМФ (цАМФ), по 2 на каждую субъединицу. Присоединение 4 молекул цАМФ к 2 регуляторным субъединицам приводит к изменению конфор-мации регуляторных протомеров и к диссоциации тетрамерного комплекса, при этом высвобождаются 2 активные каталитические субъединицы (рис. 2-32). Такой механизм регуляции обратим. Отщепление молекул цАМФ от регуляторных субъединиц приведёт к ассоциации регуляторных и каталитических субъединиц Протеинкиназы А с образованием неактивного комплекса.
Регуляция каталитической активности ферментов частичным (ограниченным) протеолизом
Некоторые ферменты, функционирующие вне клеток (в ЖКТ или в плазме крови), синтезируются в виде неактивных предшественников и активируются только в результате гидролиза одной или нескольких определённых пептидных связей, что приводит к отщеплению части белковой молекулы предшественника. В результате в оставшейся части белковой молекулы происходит конформационная перестройка и формируется активный центр фермента.
Рассмотрим механизм частичного протеолиза на примере активации протеолитического фермента трипсина (рис. 2-34). Трип-синоген, синтезируемый в поджелудочной железе, при пищеварении по протокам поджелудочной железы поступает в двенадцатиперстную кишку, где и активируется путём частичного протеолиза под действием фермента кишечника энтеропептидазы. В результате отщепления гексапептида с N-конца формируется активный центр в оставшейся части молекулы. Следует напомнить, что трипсин относят к семейству "сериновых" протеаз - активный центр фермента содержит функционально важный остаток Сер.
Частичный протеолиз - пример регуляции, когда активность фермента изменяется необратимо. Такие ферменты функционируют, как правило, в течение короткого времени, определяемого временем жизни белковой молекулы. Частичный протеолиз лежит в основе активации протеолитических ферментов, белков свёртывающей системы крови и фибринолиза, белков системы комплемента, а также пептидных гормонов.
37
21. Изоферменты: происхождение, биологическое значение, примеры. Определение ферментов и изоферментного спектра плазмы крови с целью диагностики заболеваний.
Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белка, называют изоферментами, или изоэнзимами. Они катализируют один и тот же тип реакции с принципиально одинаковым механизмом, но отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента.
Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты. Следовательно, изоферменты различаются по первичной структуре белковой молекулы и, соответственно, по физико-химическим свойствам. На различиях в физико-химических свойствах основаны методы определения изоферментов.
По своей структуре изоферменты в основном являются олигомерными белками. Причём та или иная ткань преимущественно синтезирует определённые виды протомеров. В результате определённой комбинации этих протомеров формируются ферменты с различной структурой - изомерные формы. Обнаружение определённых изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.
Изоформы лактатдегидрогеназы. Фермент лак-татдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты). Лактатдегидрогеназа - олигомерный белок с молекулярной массой 134 000 Д, состоящий из 4 субъединиц 2 типов: М (от англ, muscle - мышца) и Н (от англ, heart - сердце). Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования 5 изоформ лактатдегидрогеназы (рис. 2-35, А). ЛДГ1 и ЛДГ2наиболее активны в сердечной мышце и почках, ЛДГ4 и ЛДГ5 - в скелетных мышцах и печени. В остальных тканях имеются различные формы этого фермента.
Изоформы ЛДГ отличаются электрофоретической подвижностью, что позволяет устанавливать тканевую принадлежность изоформ ЛДГ.
Появление в эволюции различных изоформ ЛДГ обусловлено особенностями окислительного метаболизма тканей. Изоферменты ЛДГ4 и ЛДГ5 (М- типы ЛДГ) работают эффективно в анаэробных условиях, ЛДГ, и ЛДГ2 (Н-типы) - в аэробных, когда пируват быстро окисляется до СО2 и Н2О, а не восстанавливается до молочной кислоты.
При ряде заболеваний исследуют активность ЛДГ в плазме крови. В норме активность ЛДГ составляет 170-520 ЕД/л. Повышение активности наблюдают при острых поражениях сердца, печени, почек, а также при мегалобластных и гемолитических анемиях. Однако это указывает на повреждение лишь одной из перечисленных тканей.
Для постановки диагноза необходимо исследование изоформ ЛДГ в плазме крови методом электрофореза.
На рис. 2-35, В представлены электрофореграммы плазмы крови здорового человека, больного инфарктом миокарда и больного гепатитом. Выявление в плазме крови тканеспецифичес-ких изоформ ЛДГ используют в качестве диагностического теста повреждения данной ткани.
Изоформы лактатдегидрогеназы. А - строение различных изоформ ЛДГ; Б - распределение на электрофореграмме и относительные количества изоформ ЛДГ в различных органах; В - содержание изоформ ЛДГ в плазме крови в норме и при патологии (электрофореграммы - слева и фотометрическое сканирование - справа).
22. Энзимопатии наследственные (фенилкетонурия) и приобретенные (цинга). Применение ферментов для лечения болезней.
ЭНЗИМОПАТИИ (энзим[ы] + греч. pathos страдание, болезнь; син. ферментопатии) - общее название болезней, развивающихся вследствие отсутствия или снижения активности тех или иных ферментов -
38
белков, выполняющих функцию специфических катализаторов превращения веществ в организме. Выделяют наследственные и приобретенные энзимопатии. Наследственные энзимопатии связаны с генетически обусловленной недостаточностью одного или нескольких ферментов (см. Наследственные болезни). Особенностью течения наследственных Э. является наличие скрытого периода, когда болезнь не имеет выраженных клин. симптомов, но может быть заподозрена или установлена на основании биохим. исследований крови, мочи или кала. Со временем в связи с ферментативным дефектом в организме накапливаются промежуточные продукты обмена веществ, нарушающие функцию тех или иных органов, что обусловливает появление клин. признаков болезни. Обычно первые клин. симптомы наследственных Э. обнаруживаются в раннем детском возрасте, однако в ряде случаев болезнь клинически проявляется у детей более старшего возраста или у взрослых. Проявления зависят от характера нарушения того или иного вида обмена веществ.
Приобретенные энзимопатии. Одним из наиболее частых вариантов приобретенных Э. являются алиментарные Э. - патологические состояния, обусловленные стойкими нарушениями активности ферментов в связи с характером питания. Собственно алиментарные Э. могут быть обусловлены длительным дефицитом белка в питании (напр., при квашиоркоре), нарушением биосинтеза коферментов при витаминной недостаточности, угнетением синтеза металлоферментов при низком содержании в рационе соответствующих минеральных веществ. Кроме того, они могут возникать при несбалансированном питании в целом, напр. при нарушении соотношения аминокислот, жирных кислот, водо- и жирорастворимых витаминов или отдельных минеральных веществ. К развитию собственно алиментарных Э. может приводить также нарушение поступления пищевых веществ из жел. -киш. тракта в кровь при длительных поносах, атрофии слизистой оболочки кишечника и др. К алиментарным Э. относят и так наз. токсические Э., связанные с угнетением активности или биосинтеза отдельных ферментов и с неспецифическим угнетением синтеза белка различными естественными компонентами пищевых продуктов (ингибиторы протеолитических ферментов, антивитамины и др. ) или чужеродными веществами (напр., пестицидами), содержащимися в них.
Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногениости. Тем не менее энзимотерапию активно развивают в следующих направлениях:
-заместительная терапия - использование ферментов в случае их недостаточности; -элементы комплексной терапии - применение ферментов в сочетании с другой терапией.
Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при ахилии, гипо- и анацидных гастритах. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приёмом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезим-форте и др.).
В качестве дополнительных терапевтических средств ферменты используют при ряде заболеваний. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют при местном воздействии для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Ферментные препараты рибонуклеазу и дезоксирибонуклеазу используют в качестве противовирусных препаратов при лечении аденовирусных конъюнктивитов, герпетических кератитов.
Ферментные препараты стали широко применять при тромбозах и тромбоэмболиях. С этой целью используют препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы.
Фермент гиалуронидазу (лидазу), катализирующий расщепление гиалуроновой кислоты, используют подкожно и внутримышечно для рассасывания контрактур рубцов после ожогов и операций (гиалуроновая кислота образует сшивки в соединительной ткани) (см. раздел 8).
Ферментные препараты используют при онкологических заболеваниях. Аспарагиназа, катализирующая реакцию катаболизма аспарагина, нашла применение для лечения лейкозов:
39
Предпосылкой антилейкемического действия аспарагиназы послужило обнаружение в лейкоз-ных клетках дефектного фермента аспарагинсинтетазы, катализирующего реакцию синтеза аспарагина (см. схему ниже).
Лейкозные клетки не могут синтезировать аспарагин и получают его из плазмы крови. Если имеющийся в плазме аспарагин разрушать введением аспарагиназы, то в лейкозных клетках наступит дефицит аспарагина и в результате - нарушение метаболизма клетки.
23. Общая схема синтеза и распада пиримидиновых нуклеотидов. Регуляция. Оротоцидурия.
Б. "Запасные" пути синтеза пиримидиновых нуклеотидов
Использование пиримидиновых оснований и нуклеозидов в реакциях реутилизации препятствует катаболизму этих соединений до конечных продуктов с расщеплением пиримидинового кольца. В ресинтезе пиримидинов участвуют некоторые ферменты катаболизма нуклеотидов. Так, уридинфосфорилаза в обратимой реакции может рибозилироватъ урацил с образованием уридина.
Урацил + Рибозо-1-фосфат → Уридин + Н3РО4.
Превращение нуклеозидов в нуклеотиды катализирует уридин-цитидинкиназа.
Часть ЦМФ может превращаться в УМФ под действием цитидиндезаминазы и пополнять запасы уридиловых нуклеотидов.
ЦМФ + Н2О → УМФ + NH3.
В. Регуляция синтеза пиримидиновых НУКЛЕОТИДОВ
Регуляторным ферментом в синтезе пиримидиновых нуклеотидов является полифункциональный КАД-фермент. УМФ и пуриновые нуклеотиды аллостерически ингибируют, а ФРДФ активирует его карбамоилсинтетазную активность, тогда как активность аспартаттранскарбамоилазного домена ингибирует ЦТФ, но активирует АТФ (рис. 10-15).
Этот способ регуляции позволяет предотвратить избыточный синтез не только УМФ, но и всех других пиримидиновых нуклеотидов и обеспечить сбалансированное образование всех четырёх основных пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, необходимых для синтеза РНК.
Оротацидурия
Это единственное нарушение синтеза пиримидинов de novo. Оно вызвано снижением активности УМФ-синтазы, которая катализирует образование и декарбоксилирование ОМФ. Поскольку в эмбриогенезе от образования пиримидинов de novo зависит обеспечение синтеза ДНК субстратами, то жизнь плода невозможна при полном отсутствии активности этого фермента. Действительно, у всех пациентов с оротацидурией отмечают заметную, хотя и очень низкую активность УМФ-синтазы. Установлено, что содержание оротовои кислоты в моче пациентов (1 г/сут и более) значительно превосходит количество оротата, которое ежедневно синтезируется в норме (около 600 мг/сут). Снижение синтеза пиримидиновых нуклеотидов, наблюдающееся при этой патологии, нарушает регуляцию КАД-фермента по механизму ретроингибирования, из-за чего возникает гиперпродукция оротата.
40
Клинически наиболее характерное следствие оротацидурии - мегалобластная анемия, вызванная неспособностью организма обеспечить нормальную скорость деления клеток эритроцитарного ряда. Её диагностируют у детей на том основании, что она не поддаётся лечению препаратами фолиевой кислоты.
Недостаточность синтеза пиримидиновых нуклеотидов сказывается на интеллектуальном развитии, двигательной способности и сопровождается нарушениями работы сердца и ЖКТ. Нарушается формирование иммунной системы, и наблюдается повышенная чувствительность к различным инфекциям.
Гиперэкскреция оротовои кислоты сопровождается нарушениями со стороны мочевыводя-щей системы и образованием камней. При отсутствии лечения больные обычно погибают в первые годы жизни. При этом оротовая кислота не оказывает токсического эффекта. Многочисленные нарушения в работе разных систем организма вызваны "пиримидиновым голодом".
Для лечения этой болезни применяют уридин (от 0,5 до 1 г/сут), который по "запасному" пути превращается в УМФ.
Уридин + АТФ → УМФ + АДФ.
Нагрузка уридином устраняет "пиримидиновый голод", а поскольку из УМФ могут синтезироваться все остальные нуклеотиды пиримидинового ряда, то снижается выделение оротовои кислоты из-за восстановления механизма ретроингибирования КАД-фермента. Для больных оротацидурией лечение уридином продолжается в течение всей жизни, и этот нуклеозид становится для них незаменимым пищевым фактором.
Кроме генетически обусловленных причин, оротацидурия может наблюдаться:
при гипераммониемии, вызванной дефектом любого из ферментов орнитинового цикла,
за исключением карбамоилфосфатсинтетазы I. В этом случае карбамоилфосфат, синтезированный в митохондриях, выходит в цитозоль клеток и начинает использоваться на образование пиримидиновых нуклеотидов. Концентрация всех метаболитов, в том числе и оротовой кислоты, повышается. Наиболее значительная экскреция оротата отмечается при недостаточности орнитинкарбамоилтрансферазы (второго фермента орнитинового цикла); в процессе лечения подагры аллопуринолом, который превращается в оксипуринолмононуклеотид и
становится сильным ингибитором УМФ-синтазы. Это приводит к накоплению оротовой кислоты в тканях и крови.
24. Общая схема синтеза и распада пуриновых нуклеотидов. Регуляция. Подагра.
"Запасные" пути синтеза пуриновых нуклеотидов (реутилизация азотистых оснований и нуклеозидов) Огромные затраты энергии для синтеза пуриновых нуклеотидов de novo не способны полностью обеспечить субстратами синтез нуклеиновых кислот в период гаструляции и раннего роста ребёнка. Потребность в большом количестве нуклеотидов привела к развитию "запасных" путей синтеза этих "дорогих" молекул. Наибольшее значение в этом процессе имеют ферменты, осуществляющие превращение пуринов в мононуклеотиды с использованием ФРДФ как донора остатка фосфорибозы. Синтез АМФ и ГМФ из аденина и гуанина ФРДФ-зависимое фосфорибозилирование пуринов катализируют 2 фермента.
-Аденинфосфорибозилтрансфераза, ответственная за образование АМФ. -Гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза, катализирующая образование ИМФ и ГМФ из гипоксантина и гуанина соответственно.
Однако в организме при любых ситуациях этот путь синтеза пуриновых нуклеотидов, получивший название "путь спасения", имеет вспомогательное значение.
Нуклеозидкиназы
Нуклеозиды, получающиеся при катаболизме нуклеиновых кислот из нуклеотидов под действием нуклеотидаз, могут повторно фосфорилироваться, образуя нуклеозид-5'-монофосфаты за счёт переноса γ-фосфатного остатка АТФ на соответствующий субстрат. У млекопитающих такой путь пополнения запасов пуриновых нуклеотидов в клетке не имеет существенного значения. Основным ферментом этой группы является аденозинкиназа, которая ускоряет реакцию: