- •Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию
- •Работа 2. Культивирование дрожжей на питательных средах, содержащих углеводные экстракты
- •Работа 3. Использование жировых отходов мясопереработки в качестве сырья для получения белковой кормовой добавки
- •Часть 1. Определение характеристик жиросодержащих отходов
- •Часть 2. Культивирование дрожжей на жиросодержащих питательных средах
- •2. Биосинтез и выделение ферментов из культуральной жидкости микробного продуцента и из биологического сырья. Применение иммобилизованных ферментов работа 4. Регуляция синтеза экзогенных ферментов
- •Работа 5. Выделение технической рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота
- •Работа 6. Получение 6-аминопенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллинацилазы, иммобилизованной в полиакриламидный гель
- •3. Комплексная переработка биологического сырья с получением продуктов углеводной, белковой, липидной и нуклеотидной природы работа 7. Выделение полифруктозанов из растительного сырья
- •Работа 8. Экстракционное извлечение липидов из биомассы
- •Работа 9. Комплексная переработка микробного сырья с получением продуктов белковой и нуклеотидной природы
- •Часть 1 . Выделение дрожжевой рнк
- •Часть 2. Выделение “глобулиновой” фракции белка дрожжей
- •Работа 10. Получение концентрата белка из соевых бобов
- •4. Биомедицинские технологии работа 11. Основы иммунохимических методов исследования на примере реакций агглютинации и преципитации
- •Работа 12. Реакция связывания комплемента
- •5. Контроль биотехнологических производств работа 13. Основы микробиологического контроля биотехнологических производств
- •Работа 14. Анализ состава микробной кормовой биомассы
- •Методы анализа
- •Шакир Ирина Васильевна
Работа 6. Получение 6-аминопенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллинацилазы, иммобилизованной в полиакриламидный гель
Цель работы: Ознакомление с технологией получения 6-аминопенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллина с помощью иммобилизованного фермента, овладение лабораторными навыками проведения процессов с иммобилизованными ферментами, определение выхода продукта.
6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК) является полупродуктом в химическом синтезе ряда полусинтетических антибиотиков. Современная технология получения 6-АПК состоит из следующих основных стадий:
получение биомассы клеток E.coli, содержащих фермент бензилпенициллинацилазу;
выделение и очистка фермента;
иммобилизация фермента в полиакриламидный гель;
получение 6-АПК.
Последняя стадия включает в себя проведение следующих операций:
гидролиз бензилпенициллина иммобилизованным ферментом;
осветление гидролизной жидкости углем и отделение угля;
осаждение 6-АПК в изоэлектрической точке;
фильтрация и промывка полученного осадка 6-АПК водой и органическим растворителем;
вакуум-сушка готового продукта.
Клетки E. сoli выращивают методом глубинной ферментации в течение 24 ч в слабощелочной среде, содержащей очищенный кукурузный экстракт и фенилуксусную кислоту, при 25С при постоянном перемешивании и аэрации. По окончании ферментации клетки отделяют от культуральной жидкости сепарацией или центрифугированием. Полученную пасту используют для извлечения фермента с помощью следующих технологических операций:
экстракция пенициллинацилазы 0,9% раствором бутилацетата в воде при рН 8 и 40С;
отделение отработанных клеток фильтрацией;
осаждение неактивных примесей (балластных белков) из бесклеточного экстракта при 5÷8С путем добавления к экстракту сухого сульфата аммония до концентрации 20 мас.%, перемешивании в течение 30 мин и с последующим отделением балластных белков сепарацией или центрифугированием;
осаждение активного белка-фермента и его отделение. Для этого к осветленному экстракту при 5÷8С вновь добавляют сульфат аммония до уровня 12 мас.%, полученную смесь выдерживают 20 ч, при этом из экстракта выпадает осадок, содержащий преимущественно целевой фермент пенициллинацилазу;
вакуум-сушка полученного фермента.
Приготовленный таким образом ферментный препарат подвергают иммобилизации в полиакриламидный гель.
Получение иммобилизованной пенициллинацилазы состоит в радикальной полимеризации акриламида и N,N-метилен-бис-акрил-амида в водной среде в присутствии инициаторов – персульфата аммония (NH4)2S2O8 N,N,NN-тетраметилендиамина. В реакционную смесь вводят бифункциональный реагент – глутаровый альдегид, под действием которого молекулы фермента ковалентно связываются с мономерами и сшиваются друг с другом.
Приготовление иммобилизованного фермента завершают промывкой полученного геля водой.
Процесс получения 6-АПК включает в себя последовательное проведение ряда вышеуказанных операций, выполнение которых и составляет экспериментальную часть данной лабораторной работы.
Ход работы
Гидролиз бензилпенициллина под действием иммобилизованного фермента проводят в стеклянном пятигорловом реакторе, снабженном водяной рубашкой, мешалкой, электродами и термокомпенсатором рН-метра. В рубашку реактора подают нагретую до 41С воду, в реактор вносят 100 мл дистиллированной воды, затем точную навеску – 5 г соли бензилпенициллина и включают мешалку. После полного растворения соли в раствор вносят 1 мл концентрированной ортофосфорной кислоты, 15 г гель-фермента и производят начальный отсчет времени. Момент внесения фермента считают началом времени гидролиза.
В течение гидролиза реакционную смесь активно перемешивают.
Гидролиз проводят при рН 7,5÷7,6, величина которого поддерживается добавлением в реакционную среду 12,5% раствора аммиачной воды. Каждые 15 мин необходимо записывать объем щелочи, пошедшей на подтитровку.
С течением времени скорость гидролиза уменьшается, в зависимости от активности фермента процесс заканчивается через 1,5÷2,0 ч. Окончание гидролиза определяется по установившемуся постоянному значению рН раствора.
Реакционную смесь выгружают из реактора, осадок отфильтровывают через плотный бумажный фильтр на воронке Бюхнера.
Измеряют объем гидролизата и переносят в коническую колбу. Содержимое колбы охлаждают током холодной воды или на водяной бане со льдом до 4÷8С.
Осветление охлажденного гидролизата проводят активированным углем марки “Б”, взятым из расчета 1 г угля на каждые 100 мл гидролизата. После внесения угля содержимое колбы перемешивают в течение 15 мин, затем уголь отделяют от гидролизата фильтрованием в воронке Бюхнера.
Фильтрат переливают в химический стакан и вновь охлаждают в токе холодной воды или на водяной бане с тающим льдом.
После этого стакан устанавливают на столик магнитной мешалки, вводят электроды и термокомпенсатор рН-метра и ротор мешалки. При включенной мешалке по каплям добавляют из бюретки 18÷20% соляную кислоту до тех пор, пока значение рН не достигнет 3,9÷4,1. В этом интервале значений начинают выпадать кристаллы 6-АПК.
Стакан с реакционной массой снимают с мешалки, переносят на водяную баню со льдом или холодильник, где выдерживают не менее 2 ч.
Полученный осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и дважды промывают охлажденной до 4÷8С дистиллированной водой порциями, примерно вдвое большими объема полученного осадка.
Промытый осадок подсушивают на той же воронке Бюхнера и дважды промывают ацетоном порциями, примерно вдвое большими объема осадка.
Ацетон тщательно отсасывают, 6-АПК переносят в предварительно взвешенную тонкостенную чашку Петри.
Окончательное высушивание продукта производят в вакуум-сушильном шкафу при 45÷50С и остаточном давлении 2,5÷4,0 кПа до постоянной массы.
По окончании работы оценивают величину выхода 6-АПК в расчете на прогидролизованный бензилпенициллин. Для этого по химическому уравнению гидролиза бензилпенициллина и количеству израсходованной щелочи сначала находят число гидролизовавшихся миллимолей бензилпенициллина, затем определяют соотношение массы полученного осадка 6-АПК, пересчитанной на число ммоль, к количеству прогидролизованного бензилпенициллина (ммоль).
Для получения дополнительных количественных характеристик ферментативного гидролиза бензилпенициллина студентам может быть предложено уточнить величину выхода 6-АПК на основании результатов йодометрического определения 6-АПК или оценить величину константы Михаэлиса (Км) на основании анализа значений начальных скоростей ферментативной реакции гидролиза бензилпенициллина, протекающей в соответствии со следующей предполагаемой схемой превращения:
Для этого процесс гидролиза бензилпенициллина проводят дважды при одной и той же температуре, одном и том же количестве фермента, но при различном начальном содержании бензилпенициллина. Получают две кинетические кривые расходования бензилпенициллина, в которых определяют начальные скорости процесса его гидролиза (Uгi). В результате решения системы алгебраических уравнений относительно Км и 1/(k2сЕ) находят численное значение константы Михаэлиса:
Км/{(k2сЕ)∙[ БПц]о}+1/(k2сЕ) = 1/Uгi,
где i=1, 2.
Км = (k-1+k2)/k1
Контрольные вопросы
Назовите основные технологические стадии получения 6-АПК с помощью иммобилизованных ферментов. Дайте их краткую характеристику.
Какие продукты (основные и побочные) могут получаться в результате гидролиза бензилпенициллина?
Ваши предложения по утилизации фенилуксусной кислоты, остающейся в гидролизате после осаждения из него кристаллов 6-АПК.
Каковы основные стади процесса получения иммобилизованного фермента пенициллинацилазы? Какова роль персульфата аммония и глутарового альдегида при получении иммобилизованного фермента?
Какое влияние могут оказать изменения температуры и рН раствора на процесс получения 6-АПК путем гидролиза бензилпенициллина?
Какие технологические преимущества имеет вышеописанный способ получения 6-АПК по сравнению с технологией получения 6-АПК в результате направленного химического синтеза?