- •Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию
- •Работа 2. Культивирование дрожжей на питательных средах, содержащих углеводные экстракты
- •Работа 3. Использование жировых отходов мясопереработки в качестве сырья для получения белковой кормовой добавки
- •Часть 1. Определение характеристик жиросодержащих отходов
- •Часть 2. Культивирование дрожжей на жиросодержащих питательных средах
- •2. Биосинтез и выделение ферментов из культуральной жидкости микробного продуцента и из биологического сырья. Применение иммобилизованных ферментов работа 4. Регуляция синтеза экзогенных ферментов
- •Работа 5. Выделение технической рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота
- •Работа 6. Получение 6-аминопенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллинацилазы, иммобилизованной в полиакриламидный гель
- •3. Комплексная переработка биологического сырья с получением продуктов углеводной, белковой, липидной и нуклеотидной природы работа 7. Выделение полифруктозанов из растительного сырья
- •Работа 8. Экстракционное извлечение липидов из биомассы
- •Работа 9. Комплексная переработка микробного сырья с получением продуктов белковой и нуклеотидной природы
- •Часть 1 . Выделение дрожжевой рнк
- •Часть 2. Выделение “глобулиновой” фракции белка дрожжей
- •Работа 10. Получение концентрата белка из соевых бобов
- •4. Биомедицинские технологии работа 11. Основы иммунохимических методов исследования на примере реакций агглютинации и преципитации
- •Работа 12. Реакция связывания комплемента
- •5. Контроль биотехнологических производств работа 13. Основы микробиологического контроля биотехнологических производств
- •Работа 14. Анализ состава микробной кормовой биомассы
- •Методы анализа
- •Шакир Ирина Васильевна
Работа 12. Реакция связывания комплемента
Комплемент – ферментная система, необходимая для осуществления лизиса клеток (гемолиз, бактериолиз и др.) после присоединения к ним специфических антител. Эта система имеется в кровяной сыворотке всех млекопитающих. Особенно активна система комплемента у морской свинки. В классической иммунологии сыворотка морской свинки чаще всего используется в качестве комплемента при постановке реакций бактериолиза или гемолиза. Сыворотка, прогретая при 56оС в течение 30 мин, лишается комплементарной активности.
Если к свежей сыворотке крови животного, иммунизированного чужеродными эритроцитами, добавить эритроциты этого же животного, то вскоре произойдет их агглютинация, а затем лизис (гемолиз). Гемолиз не произойдет, если эритроциты добавить не к свежей сыворотке, а к сыворотке, предварительно прогретой при 56оC в течение 30 мин. Однако при добавлении к такой прогретой сыворотке небольшого количества свежей сыворотки любого другого животного, даже относящегося к другому виду, агглютинированные эритроциты немедленно начнут лизироваться. Это явление связано с присутствием в сыворотке крови комплемента, который воздействует не на антиген сам по себе, а на комплекс антиген – антитело. Иначе говоря, специфические антитела как бы подготавливают соответствующий антиген к действию комплемента, сенсибилизируют его.
Система комплемента включает девять различных протеинов (факторов), некоторые из них состоят из комплекса протеиновых субъединиц. Девять основных протеинов обозначают символами С1, С2 и т.д., а полипептидные субъединицы С1 – С1q, C1r, C1s. Вся система представляет собой последовательную цепь ферментов, активация которой инициируется комплексом антиген – антитело. В активации участвуют ионы Ca2+ и Mg2+. Конечный продукт С9 осуществляет лизис клеток. Последовательность включения отдельных компонентов комплемента такова: антиген – антительный комплекс активизирует С3 компонент комплемента, далее С3С1, С2С3С4, , С5С6С7, С8С9, С9лизис. Основное звено – компонент С3, который относится к 2-глобулинам, его молекулярная масса около 180000, концентрация в сыворотке крови 1500 мкг/мл.
Инициирующим фактором является комплекс антиген – антитело, поскольку при его образовании молекулы IgM и IgG меняют свою конформацию так, что на Fc-фрагменте обнажается участок, взаимодействующий с компонентом С3 комплемента. В присутствии ионов Ca2+ С3 активизируется, активация передается на С1 фактор и включается весь каскад.
Реакция связывания комплемента является одним из наиболее чувствительных иммунологических методов. Поэтому знание природы и свойств комплемента – необходимое условие для тех, кто предполагает проводить иммунологические исследования.
Антитела иммунной сыворотки, вызывающие вместе с комплементом лизис клеток, были названы лизинами. Так как при этой реакции всегда необходимо присутствие комплемента, ее часто называют реакцией связывания комплемента, а антитела – комплементсвязывающими.
Реакция связывания комплемента протекает в две фазы:
первая фаза – антитело, встретившись с соответствующим антигеном, образует комплекс аниген – антитело;
вторая фаза – комплекс антиген – антитело адсорбирует из окружающей среды комплемент. При отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом образование комплекса антиген – антитело не имеет места и адсорбции комплемента не происходит. Если в среде содержится только один из компонентов комплекса, адсорбции комплемента также практически не произойдет и последний останется в жидкости.
Для определения наличия в среде свободного комплемента разработана специальная методика, в которой в качестве индикатора используют эритроциты, сенсибилизированные соответствующим антигеном – гемолизином (гемолитическая система). При наличии в среде свободного комплемента обработанные гемолизином эритроциты подвергаются легко наблюдаемому невооруженным глазом гемолизу. При отсутствии комплемента в среде взвесь сенсибилизированных эритроцитов сохраняет свой первоначальный вид
Реакция связывания комплемента может быть использована с диагностической целью:
если в руках исследователя имеется специфический антиген, можно определить в исследуемом материале (крови) присутствие специфического к нему антитела и на этом основании поставить диагноз;
если в распоряжении исследователя имеются специфические антитела (иммунные сыворотки), можно определить характер изучаемого антигена.
Реакция связывания комплемента может быть также использована для оценки титра и специфичности получаемых на животных иммунных сывороток, для изучения антигенной структуры различных тканей и органов, в исследованиях, посвященных сравнительному изучению антигенных свойств тканей различных животных и человека, и т.д.
Цель работы: Ознакомление с одной из ферментных систем неспецифической защиты организма – системой комплемента, освоение реакции связывания комплемента.
Ход работы
Реакция связывания комплемента является высокочувствительным методом исследования, позволяющим выявлять очень незначительные количества антигенов и антител. Метод предполагает следующую последовательность этапов постановки опыта:
приготовление гемолитической системы,
титрование комплемента для определения его рабочей дозы,
титрование антигена для определения его рабочей дозы,
главный опыт – титрование сыворотки.
Гемолитическая система
Исходным материалом для приготовления гемолитической системы служит стандартная гемолитическая сыворотка с титром 1:1200 и 3% взвесь бараньих эритроцитов (табл. 1).
Гемолитическую сыворотку и взвесь эритроцитов готовят в разных колбах, затем сливают в одну колбу и ставят в термостат при 37оС на 30 мин. Готовую смесь хранят в темном месте при комнатной температуре.
Таблица 1
Соотношение компонентов гемолитической системы для проведения реакции связывания комплемента микрометодом
Объем компонентов, мл |
Объем смеси, мл |
Объем гемолитической системы, мл |
0,025 мл гемолитической сыворотки + 10 мл физиологического раствора
0,3 мл эритроцитов + 9,7 мл физиологического раствора |
10
10 |
20 |
Титрование комплемента
Для определения рабочей дозы комплемента свежую сыворотку морской свинки титруют в небольших пробирках (удобны пробирки диаметром 5 мм). Исходное разведение сыворотки – 1:10. Необходимые количества комплемента отмеривают микропипеткой. Затем в каждую пробирку приливают по 0,2 мл гемолитической системы. Пробирки инкубируют в термостате при 37оС в течение 1 ч (табл. 2).
За титр комплемента принимают то минимальное количество комплемента, которое вызывает полный гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (в табл. 2 титр комплемента равен 0,025 мл, рабочая доза – 120 % титра, т.е. 0,03 мл).
Таблица 2
Примерная схема титрования комплемента
№ п/п |
Комплемент, мл (1:10) |
Физиологический раствор,мл |
Примерные результаты |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 К* |
0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 0,045 0,050 - |
0,295 0,290 0,285 0,280 0,275 0,270 0,265 0,260 0,255 0,250 0,300 |
++++ +++ ++ + Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз ++++ |
К* – контроль гемолитической системы
Титрование антигена
Для определения рабочей дозы антигена его титруют. Для этого в пробирки отмеривают различные количества изучаемого экстракта. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,1 мл комплемента, разведенного физиологическим раствором таким образом, чтобы в 0,1 мл содержалась его рабочая доза. Пробирки ставят в термостат при 37оС на 1 ч. После этого в каждую пробирку приливают по 0,2 мл гемолитической системы и вновь помещают их на 1 ч в термостат (табл. 3).
За титр антигена принимают максимальное количество антигена, при котором еще наблюдается гемолиз (титр антигена равен 0,01 мл, а рабочая доза – 0,005 мл).
Таблица 3
Примерная схема титрования антигена
№ п/п |
Антиген, мл |
Физиологический раствор, мл |
Примерные результаты |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 К* К** |
0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0,01 0,004 0,002 0,0004 0,0002 - - |
0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,19 0,196 0,198 0,1996 0,1998 0,2 0,3 |
++++ ++++ +++ ++ + Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз ++++ |
К* – контроль комплемента;
К** – контроль гемолитической системы.
Главный опыт (с одновременным титрованием сыворотки)
Готовят разведения сыворотки: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. В пробирки разливают по 0,1 мл сыворотки в соответствующих разведениях, начиная с последней пробирки, содержащей сыворотку в максимальном разведении. Затем в каждую пробирку приливают по 0,1 мл разведенного антигена и по 0,1 мл комплемента, содержащих в этом объеме рабочую дозу. Опыт дополняют контролями разведений сыворотки (0,1 мл каждого разведения сыворотки + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента), контролем антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента), контролем гемолитической системы (0,3 мл физиологического раствора). Все пробирки встряхивают и помещают на 1 ч в термостат. Затем во все пробирки приливают по 0,2 мл гемолитической системы, пробирки снова встряхивают и помещают в термостат на 1 ч (табл. 4).
Таблица 4
Примерная схема постановки главного опыта
№ пробирки |
Разведение сыворотки |
Антиген (рабочая доза), мл |
Физиологи-ческий раствор, мл |
Примерные результаты | ||
1:20 |
1:40 |
1:80 | ||||
1 2 (к)1 3 4 (к) 5 6 (к) К* К** К*** |
0,1 0,1 |
0,1 0,1
|
0,1 0,1 |
0,1 - 0,1 - 0,1 - 0,1 - - |
- 0,1 - 0,1 - 0,1 0,1 0,2 0,3 |
++ Гемолиз + Гемолиз Гемолиз Гемолиз
Гемолиз Гемолиз ++++ |
(к)1 – контрольные пробирки;
К* – контроль антигена;
К** – контроль комплемента;
К*** – контроль гемолитической системы.
При наличии специфической реакции антигена с антителом в пробирках, содержащих и сыворотку, и антиген, наблюдается задержка гемолиза (задержка гемолиза наблюдается в пробирках 1 и 3). За титр исследуемой сыворотки принимают максимальное разведение сыворотки, при котором еще происходит задержка гемолиза (титр сыворотки равен 1:40). При отсутствии специфической реакции антигена с антителом наблюдается полный гемолиз во всех опытных пробирках.
Контрольные вопросы
Понятие о системе комплемента, ее роль в организме.
На чем основана реакция связывания комплемента?
Применение реакции связывания комплемента.