- •Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию
- •Работа 2. Культивирование дрожжей на питательных средах, содержащих углеводные экстракты
- •Работа 3. Использование жировых отходов мясопереработки в качестве сырья для получения белковой кормовой добавки
- •Часть 1. Определение характеристик жиросодержащих отходов
- •Часть 2. Культивирование дрожжей на жиросодержащих питательных средах
- •2. Биосинтез и выделение ферментов из культуральной жидкости микробного продуцента и из биологического сырья. Применение иммобилизованных ферментов работа 4. Регуляция синтеза экзогенных ферментов
- •Работа 5. Выделение технической рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота
- •Работа 6. Получение 6-аминопенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллинацилазы, иммобилизованной в полиакриламидный гель
- •3. Комплексная переработка биологического сырья с получением продуктов углеводной, белковой, липидной и нуклеотидной природы работа 7. Выделение полифруктозанов из растительного сырья
- •Работа 8. Экстракционное извлечение липидов из биомассы
- •Работа 9. Комплексная переработка микробного сырья с получением продуктов белковой и нуклеотидной природы
- •Часть 1 . Выделение дрожжевой рнк
- •Часть 2. Выделение “глобулиновой” фракции белка дрожжей
- •Работа 10. Получение концентрата белка из соевых бобов
- •4. Биомедицинские технологии работа 11. Основы иммунохимических методов исследования на примере реакций агглютинации и преципитации
- •Работа 12. Реакция связывания комплемента
- •5. Контроль биотехнологических производств работа 13. Основы микробиологического контроля биотехнологических производств
- •Работа 14. Анализ состава микробной кормовой биомассы
- •Методы анализа
- •Шакир Ирина Васильевна
Часть 1 . Выделение дрожжевой рнк
Ход работы
1. Подготовить установку к работе. Установка состоит из стеклянного реактора с мешалкой, рубашкой и обратным холодильником. Обогрев осуществляется подачей горячей воды из ультратермостата. При подготовке установки к работе необходимо:
а) подсоединить рубашку реактора к ультратермостату;
б) подсоединить мешалку и обратный холодильник;
в) проверить работу мешалки;
г) включить подачу холодной воды в обратный холодильник;
д) установить с помощью контактного термометра температуру воды 82÷83оС;
е) включить подачу воды в реактор.
2. Взвесить 37 г сухих дрожжей. Приготовить 170 мл экстрагента (1,5 моль/л диаммонийфосфата), для этого рассчитать требуемое количество концентрированного раствора соли и воды. Концентрация исходного раствора соли задается преподавателем.
3. После прогрева термостата до требуемой температуры экстракции (80оС) внести в реактор через свободное горло 37 г сухих дрожжей и 170 мл приготовленного экстрагента. Затем включить мешалку. Когда суспензия прогреется до требуемой температуры (80оС), через обратный холодильник добавить 5 мл концентрированного раствора аммиака и начать отсчет времени экстракции (15 мин).
4. По истечении этого времени отключить подачу воды в обратный холодильник и рубашку реактора, отсоединить мешалку, термометр и холодильник, перелить содержимое реактора в коническую колбу или стакан и охладить до комнатной температуры.
5. Охлажденную суспензию по 25 мл разлить в центрифужные стаканы и отцентрифугировать при 6000 об/мин в течение 15 мин. Денуклеинизированную биомассу собрать в отдельный стакан и оставить для выполнения части 2 лабораторной работы. Полученный бесклеточный экстракт при необходимости отфильтровать через бумажный фильтр и поставить на 30 мин в холодильник, измерив его объем.
6. Измерить концентрацию нуклеиновых кислот в экстракте методом А.С. Спирина (см. Приложение 1). Пробу экстракта необходимо для анализа развести в 200 раз.
7. Провести осаждение РНК в ИЭТ. Для этого необходимо поместить в охлажденный экстракт электроды рН-метра и довести значение рН среды до 1,8÷2,0 раствором концентрированной соляной кислоты. Стакан с осадком поставить на 30÷40 мин в холодильник.
8. Осадок РНК отделить от надосадочной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Осадок промыть подкисленной водой, добавив по 10 мл последней в каждый центрифужный стакан. При необходимости промывные воды отделить центрифугированием (6000 об/мин в течение 5 мин).
9. Промыть осадок спиртом или ацетоном, добавив в каждый центрифужный стакан по 10 мл растворителя. Отработанный растворитель при необходимости отделить центрифугированием (6000 об/мин в течение 5 мин) и слить в сборник отработанного спирта (ацетона).
10. Осадок РНК высушить в центрифуге, включив ее на 20 мин при 1000 об/мин с открытой крышкой. Определить массу полученного осадка.
11. Измерить объем надосадочной жидкости, полученной в п. 8, и определить в ней концентрацию нуклеиновых кислот методом Спирина.
12. Навеску полученной РНК массой 200 г растворить в 0,1 н NaOH в мерной колбе на 25 мл. Определить содержание в препарате нуклеиновых компонентов по методу А.С. Спирина и белковых веществ по методу Лоури (см. Приложение 1). Для анализа по методу А.С. Спирина полученный раствор развести в 100 раз.
В работе необходимо рассчитать:
а) степень экстракции нуклеиновых компонентов:
Хэкст = [НК]э Vэ /(m A 100),
где [НК]э – концентрация нуклеиновых кислот в экстракте, мг/л;
Vэ – объем экстрагента, равный 175 мл (170 мл соли и 5 мл аммиака), л;
m – масса исходных дрожжей, мг;
А – содержание нуклеиновых кислот в дрожжах (% задается преподавателем).
б) степень осаждения РНК в ИЭТ:
Хиэо = ([НК] V1 - [НК]н/о V2)/[НК]эV1,
где V1 – объем экстракта, л;
V2 – объем надосадочной жидкости, л;
[НК]н/о – концентрация нуклеиновых кислот в надосадочной жидкости, мг/л.
Контрольные вопросы
Роль нуклеиновых кислот в микробной клетке.
Практическое значение препаратов нуклеиновых кислот и продуктов их гидролиза.
Способы извлечения нуклеиновых кислот из микробной клетки.
Роль аммиака и диаммонийфосфата в экстракции РНК из клеток дрожжей.
Известно, что степень осаждения РНК в изоэлектрической точке растет с увеличением концентрации РНК в растворе. Какие способы Вы можете предложить для концентрирования полученного в данной работе экстракта?
Какой растворитель (спирт или ацетон) целесообразнее использовать для сушки РНК и почему?
Известен способ извлечения РНК из клеток дрожжей в виде белково-нуклеинового комплекса. Предложите состав экстрагента для этого случая.