Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию

Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева

ОБЩАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Лабораторный практикум

Утверждено Редакционным советом

университета в качестве учебного пособия

Москва 2008

УДК 663.18:664 (075.8)

ББК 28.072.я73

0-28

Рецензенты:

Кандидат биологических наук, научный сотрудник

Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Е. Г. Салина

Кандидат технических наук, доцент кафедры промышленной экологии

Российского химико-технологического университета им. Д. И. Менделеева

И. О. Тихонова

Общая биотехнология. Лабораторный практикум: учеб. пособие/ 0-28 И. В. Шакир, А. А. Красноштанова, Е. В. Парфенова, Н. А. Суясов,

Е. С. Бабусенко, В. Д. Смирнова. – М.: РХТУ им. Д. И. Менделеева, 2008. – 120 с.

ISBN 978-5-7237-0682-8

В лабораторный практикум включены задания, цель которых привить студентам навыки работы в лаборатории, познакомиться с основными принципами контроля и управления биотехнологическими процессами, назначением, устройством и принципами работы различных лабораторных установок.

Основное внимание уделено освоению студентами-биотехнологами методов культивирования микроорганизмов в лабораторных ферментерах, процессов комплексной переработки растительного сырья и микробной биомассы, а также методов микробиологического и химического контроля промежуточных и конечных продуктов.

Предназначается для студентов V курса специальности “Биотехнология”, а также бакалавров и магистров, специализирующихся по направлению “Химическая технология и биотехнология”.

УДК 663.18: 664(075.8)

ББК 28.072.я73

ISBN 978-5-7237-0682-8 © Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева, 2008

© Шакир И. В., Красноштанова А. А.,

Парфенова Е. А., Суясов Н. А.,

Бабусенко Е. С., Смирнова В.Д., 2008

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Биотехнология – использование культур клеток бактерий, дрожжей, животных или растений, метаболизм и биосинтетические возможности которых обеспечивают выработку специфических веществ. Согласно определению Европейской биотехнологической федерации, созданной в 1978 г., биотехнология на основе применения знаний и методов биохимии, микробиологии, генетики и химической техники позволяет извлекать выгоду в технологических процессах из свойств микроорганизмов и клеточных структур. Она создает возможность получения с помощью легко доступных и возобновляемых ресурсов тех веществ и соединений, которые важны для жизни и благосостояния людей. На сегодняшний день биотехнология стремительно выдвигается на передний край научно-технического прогресса.

Методы исследования, которые используются в биотехнологии, включают весь богатый арсенал методов органической, физической, аналитической, общей химии, а также генетики, микробиологии и других направлений научной деятельности человечества.

Данное методическое пособие направлено на ознакомление студентов, изучающих биотехнологию, с основными методами и технологическими приемами, применяемыми при комплексной переработке растительного, животного и микробного сырья; исследованию процессов глубинного культивирования микроорганизмов с целью получения биологически активных веществ; рассмотрению ключевых аспектов медицинской биотехнологии.

1. Культивирование клеток промышленных микроорганизМОВ – ПРОдуцентов белка и БАВ

РАБОТА 1. Использование комплекса ЭВМ – ферментер для изучения процессов биосинтеза

Цель работы: Ознакомление с принципами контроля и управления процессами биосинтеза с использованием ЭВМ, с назначением, устройством и принципами работы, возможностями установки “Фермус-3”, конструкцией датчиков рН, рО₂, Еh, перемешивающего устройства и т.д., используемых в установке для проведения управляемого процесса культивирования.

Ход работы

После краткого ознакомления с установкой “Фермус-3” (см. инструкцию по эксплуатации установки “Фермус-3”) необходимо приступить к проведению процесса глубинного культивирования микроорганизмов. Для этого получают задание от преподавателя и сведения об изучаемом процессе; вместе с преподавателем задают и вводят в блок управления ферментером необходимые автоматически контролируемые условия культивирования, вносят посевной материал и приступают к проведению ферментационного процесса.

В ходе ферментации:

• проводят отбор проб из ферментера (объем отбираемой пробы 8÷10 мл, перед отбором предварительно необходимо слить жидкость из мертвого пространства пробоотборного шланга);

• определяют величину оптической плотности суспензии микроорганизмов на ФЭК (кюветы l÷5 мм, длина волны 540 нм), при необходимости готовя соответствующие разведения (водопроводной водой) так, чтобы оптическая плотность суспензии была в интервале 0,05÷0,35; показания оптической плотности определяют каждые 30 мин в трех повторениях (определения нужно выполнять оперативно, поскольку популяция микроорганизмов в отобранной пробе, оставленной в покое в тепле, может еще в течение какого-то времени размножаться; перед приготовлением разведений и определением оптической плотности пробу надо интенсивно встряхнуть, поскольку часть клеток может успеть осесть на дно пробирки или другого сосуда с отобранной пробой);

• контролируют и записывают каждые 15 мин основные параметры ферментации (температуру, концентрацию растворенного кислорода, рН, число оборотов мешалки) по показаниям на индикаторе блока управления ферментера или на мониторе ЭВМ, а также расход воздуха – по показаниям ротаметра и расход титрующего агента – по показаниям на бюретке с титрантом;

• осуществляют микробиологический контроль роста популяции под микроскопом (в начале и в конце занятия); для наблюдения под микроскопом необходимо приготовить препарат типа “раздавленная капля” и зарисовать картину в поле зрения микроскопа (с объективом 40^х);

• осуществляют визуальный контроль за протеканием процесса и работой установки.

Показания вносят в таблицу:

№ пробы	Время, ч	Оптическая плотность биомассы					T, oC	рO2, %	pH	Eh., Â	Примечание
		Разведение	Показания ФЭКа			Среднее значение

Определение дыхательной активности культуры микроорганизмов в ферментере

Проблема снабжения кислородом физиологически активной культуры микроорганизмов, осуществляющих биосинтез в аэробных условиях, является одной из наиболее важных в организации ферментационного процесса.

Особенно существенное значение эта проблема играет при биологической очистке сточных вод в аэротенках, поскольку на аэрацию биоценоза в данном случае тратится более половины всех эксплуатационных затрат.

Ввиду больших расходов на аэрацию очень важно подобрать оптимальный режим культивирования и аэрации, правильно выбрать конструкцию перемешивающего устройства и определить реальную потребность микробной популяции в кислороде.

Для определения режимов аэрации в принципе можно использовать кинетические зависимости изменения концентрации растворенного кислорода (pO₂) в различных условиях, фиксируя значение pO₂ датчиком растворенного кислорода. В установке “Фермус-3” показатели pO₂ непосредственно выводятся на экран монитора ЭВМ (IBM PC) в графическом виде (в режиме “on line”).

Данные также могут быть обработаны после проведения ферментационного процесса (в режиме “off line”).

Скорость изменения концентрации растворенного кислорода dс/dt (или dpO₂/dt) можно представить следующей зависимостью:

dс/dt = V_{поступл}-V_{потребл}

Кислород из воздуха поступает в среду за счет барботажа воздуха и перемешивания среды. Скорость его поступления можно представить зависимостью:

V_{поступл} =K(с*-с),

где K– объемный коэффициент массопереноса кислорода;

с* – равновесная концентрация кислорода при данном парциальном

давлении кислорода и данной температуре;

с – концентрация кислорода в среде культивирования.

Скорость потребления кислорода связана с дыхательной активностью популяции и определяется зависимостью:

V_{потребл} = ()∙с_АСБ,

где – удельная дыхательная активность микробной популяции (гО₂/гАСБ), АСБ – абсолютно сухая биомасса;

с_АСБ – концентрация биомассы в ферментационной среде.

В условиях экспоненциального роста микробной популяции и неизменности расходных коэффициентов (кг потребленного кислорода на кг потребленного субстрата),(кг потребленного кислорода на кг накопленной биомассы)V _{потребл} можно выразить как:

V_{потребл} = ·,

где  – удельная скорость роста биомассы микроорганизмов.

Датчик концентрации растворенного кислорода фиксирует в среде концентрацию с, отражающую суммарное равновесие в данный момент между поступлением и потреблением. V_{потребл} в первом приближении можно найти, отключив на некоторый момент времени барботаж и перемешивание. В этом случае концентрация начнет резко падать (если культура активна), а кривая с = f(t) будет отражать изменение только дыхательной активности с течением времени. На основе этой кривой можно оценить скорости потребления субстрата и накопления биомассы (через исоответственно) в текущий момент времени и построить зависимость изменения скорости потребления кислорода популяцией от концентрации растворенного кислорода V_{потребл} = f(с) (аналог кривой Михаэлиса – Ментен для углеродного субстрата).

Используя данный метод, в лабораторной работе можно определить зависимости удельной дыхательной активности микробной популяции от концентрации растворенного кислорода, т.е. dс/(dt∙X) = f(с).

Если после отключения аэрации концентрация кислорода в среде культивирования снизилась до величин, близких к лимитирующим (0÷10% от с*), то в первый момент после повторного включения аэрации и перемешивания концентрация кислорода в среде культивирования должна резко возрасти. При этом сразу же после включения аэрации скорость потребления кислорода V_{потребл} еще незначительна и можно принять, что увеличение с обусловлено только V_{поступл}, т.е. массообменными характеристиками ферментера. По углу наклона кривой возрастания с в первый момент после включения аэрации можно определить V_{поступл} и соответственно K. Однако непосредственное наблюдение за кривой роста концентрации растворенного кислорода с помощью датчика pO₂ дает заниженные результаты определения Kиз-за наличия запаздывания фиксирования показателей рО₂ датчиком по отношению к реальным изменениям.

Для определения удельной дыхательной активности микробной популяции необходимо знать концентрацию биомассы Х. Концентрацию биомассы определяют путем пересчета показателей оптической плотности на сухую массу. В соответствии с коэффициентом пересчета для данных условий определения 1 единица оптической плотности соответствует концентрации, равной 0,5 г/л АСБ (абсолютно сухая биомасса).

В отчете о лабораторной работе необходимо представить условия проведения ферментационного процесса и условия определения дыхательной активности, результаты измерений, сведенные в таблицу, графики изменения концентрации биомассы, температуры, рО₂, рН, расхода титранта от времени (в случае использования режима автоматического титрования), логарифмическую зависимость изменения концентрации биомассы от времени (с ее помощью найти удельную скорость роста микроорганизмов), кривую зависимости удельной скорости потребления кислорода от концентрации растворенного кислорода dс/(dt∙X) = f(с), данные контроля под микроскопом.

Контрольные вопросы

1. Назначения, принципы использования и работы комплексов ЭВМ – ферментер.

2. Устройство установки “Фермус-3”, ее возможности.

3. Принцип работы и устройство датчиков pH, pO₂, Eh, Т^o, систем пеногашения, термостатирования, аэрирования.

4. Методические особенности и возможные ошибки при определении концентрации биомассы на ФЭКе.

Задача (Конкретные цифры задаются преподавателем).

Допустим, что культура микроорганизмов растет в оптимальных условиях по экспоненциальному закону в периодическом режиме на углеродном субстрате ........при температуре …..^оС, давлении …. Па при содержании кислорода в подаваемом воздухе ...….% с выходом биомассы …. кг биомассы на кг субстрата.

Пусть за время.…. ч биомасса выросла с .....г/л до…....г/л. Лимитирование роста биомассы начинается при концентрации кислорода ….....% от насыщения при заданных условиях культивирования.

Определить, хватит ли массообменной мощности перемешивающего устройства, обеспечивающего коэффициент массопереноса по кислороду на уровне ...... ч^-1, чтобы на протяжении всего времени роста биомассы лимитирование роста кислородом не наблюдалось.

Какую конструкцию перемешивающего устройства можно применить в случае нехватки (избытка) массообменных возможностей ферментера для заданных условий и как это отразится на теплообменных характеристиках ферментера и других параметрах?

Прочими условиями (высотой столба жидкости в ферментере, изменением концентрации кислорода в газовой фазе по мере продвижения пузырьков воздуха через слой жидкости и др.) в расчетах пренебречь.