Карабинцева Фармацевтическая технология методички / Экологическая биотехнология

Рис. 24. Колонии Serratia marcescens на агаризованной питательной среде

Большинство промышленных инсектопатогенных штаммов принадлежит к роду Bacillus, и основная масса препаратов (свыше 90 %) изготовлена на основе Bacillus thuringiensis (Bt), имеющих свыше 22 серотипов. Штаммы Bt используют для борьбы с различными вредителями — гусеницами, комарами, мошками. Патогенное действие Bt на насекомых связано с токсинами, экзоферментами (лецитиназы, хитиназы, протеазы), турицинами (антибиотическими веществами, продуцируемыми Bt). Один из вырабатываемых Bt токсинов — δ-эндотоксинбелковойприроды—образуетсяобычноодновременно со спорой и после разрушения клетки выделяется в среду (рис. 25).

Рис. 25. Внутриклеточные кристаллы Bacillus thuringiensis

121

Кристаллы нетоксичны, но при попадании в пищеварительный тракт насекомых под воздействием щелочных протеаз разрушаются с образованием действующего токсина. Типичными последствиями воздействия δ-эндотоксина являются паралич кишечника, прекращение питания, развитие общего паралича и гибель насекомого. Кристаллы варьируют между различными серотипами и изолятами Bt и обладают широким спектром активности против различных насекомых.

Технология получения биопестицидов на основе энтомопатогенных бактерий представляет собой типичный пример периодической гомогенной аэробной глубинной культуры, реализующейся в строго стерильныхиконтролируемыхусловиях.Посленакоплениявкультуральной жидкости спор и кристаллов их отделяют. Товарные формы препарата — сухой порошок и стабилизированная паста.

Кроме того, бактерии применяются и для борьбы с фитопатогена- ми.Так,препаратBioSave(продуцентPseudomonassyringaeESC6–10) используется для защиты цитрусовых и плодовых деревьев от гриб-

ных патогенов; Blue-Circle (продуцент P. cepacia type Wisconsin) —

против Fusarium, Pythium и сосущих нематод; Intercept (продуцент P. cepacia) — для защиты вегетирующих растений кукурузы, хлоп-

ка от Pythium sp., Rhizoctonia solani, Fusarium sp.; Victus (продуцент

P.fluorescensNCIB 12089) — против бактериальной пятнистости растений; Псевдобактерин (продуцент P. aureofaciens BS1393) применяется в качестве средства защиты для зерновых и овощных культур от фитопатогенов.

6.5.2. Энтомопатогенные грибы

Среди возбудителей микозов вредных насекомых одной из важнейших групп являются энтомофторовые грибы (Zygomycetes, Entomophthorales). Уникальность этих грибов заключается в том, что большинство их представителей, будучи облигатными паразитами членистоногих, способны в короткий срок и на обширных территорияхвызыватьмассовыезаболевания(эпизоотии)ивыступатьвкачестве одного из главнейших механизмов регуляции численности своих хозяев (табл. 7). Первые упоминания об энтомофторозе относятся к 1782 г., когда Де Греем было опубликовано сообщение о заболевании комнатной мухи, возбудителем которого был гриб Entomophthora muscae.

122

К энтомопатогенным аско- и дейтеромицетам, задействованным в прикладных биотехнологических работах, относят грибы ро-

дов Beauveria (рис. 26), Tolypocladium, Metarhizium, Paecilomyces,

Nomuraea, Verticillium, Hirsutella, Culicinomyces.

Рис. 26. Колонии энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana на агаризованной питательной среде (слева) и на особях колорадского жука (справа)

(фотографии предоставлены Т. В. Тепляковой)

Проникновение грибов в организм насекомых-хозяев может происходить практически через любые участки тела: кишечник, трахею, поровые канальцы в кутикуле, склериты, межсегментарные участки. На основе гриба Beauveria был разработан первый отечественный грибной препарат против колорадского жука Боверин. После зараже-

123

ния насекомого клетки гриба выделяют токсин, относящийся к циклодепсипептидам — боверицин.

6.5.3. Хищные грибы

Для борьбы с паразитическими нематодами в настоящее время перспективноприменениенесовершенныхгрибовродовArthrobotrys,

Duddingtonia, Dactylella, Dactylaria, Dactylariopsis, Candelabrella,

Golovinia и др., входящих в экологическую группу хищных грибовгифомицетов. Гифы хищных грибов образуют различные улавливающие приспособления, в которых идет синтез биологически активных соединений — аттрактантов (веществ, привлекающих нематод), токсинов, ферментов, участвующих в механизме хищничества. Ловушки в форме клейких петель и их сплетений позволяют хищным грибам улавливать нематод и переваривать их содержимое (рис. 27).

Рис. 27. Нематода в ловчих петлях нематофагового гриба Duddingtonia (фотография предоставлена Т. В. Тепляковой)

Получение препаратов хищных грибов основано на поверхностном выращивании и получении спорово-мицелиального комплекса грибов на сыпучих и твердых субстратах. В условиях промышленного производства экономически выгодно и экологически целесообразно получение жидкой формы биопрепарата. Основным условием управляемого культивирования мицелиальных грибов является возможность гомогенного распределения мицелия по всему объему питательной среды биореактора и создание в каждой его точке опти-

124

мальных условий для роста биомассы. Оптимальным для наработки биомассы хищных грибов считается газовихревой безградиентный биореактор, обеспечивающий щадящие (мягкие) условия перемешивания микроорганизмов. Использование препарата против нематодпозволяетдобитьсябольшогоэкономическогоэффектапривыращивании различных сельскохозяйственных культур.

6.5.4. Энтомопатогенные вирусы

Вирусные заболевания описаны у представителей многих отрядов насекомых, а общее количество ассоциированных с насекомыми вирусов достигает более 1000. По современной классификации вирусы, поражающие насекомых, представлены в 13 семействах, причем несколько из них включают только энтомопатогенные вирусы. Абсолютное большинство исследований по вирусному патогенезу насекомых посвящено вирусам из семейства Baculoviridae, которые вызывают ядерные полиэдрозы и гранулезы. Эти заболевания известны только у насекомых и названы так благодаря форме белковых включений (полиэдров и гранул), образующихся в инфицированных клетках.Вирусыданногосемействапоражаютбольшинствомассовыхвидов фитофагов, имеющих большое хозяйственное значение (табл. 8). Среди них можно отметить сибирского, непарного и кольчатого шелкопрядов, шелкопряда-монашенку, американскую белую бабочку, капустную, луговую, сосновую и хлопковую совки, некоторых пилильщиков и пядениц. Вирус полиэдроза поражает также тутового шелкопряда, роль которого для хозяйственной деятельности человека, особенно в недалеком прошлом, трудно переоценить.

Таблица 8

Специфичность энтомопатогенных вирусов по отношению к насекомым

125

7 ФИТОРЕМЕДИАЦИЯ

Комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферного воздуха с использованием зеленых растений получил название фиторемедиации. Растения и водоросли способны к некоторой трансформации сложных органических соединений (пестицидов, углеводородов, тяжелых металлов, полихлорированных бифенилов, фосфорорганических инстектицидов и ПАВ), но не способны, в отличие от микроорганизмов, к полной минерализации ксенобиотиков и использованию этих веществ в качестве источника энергии.

Факторами, обеспечивающими трансформацию загрязнителей в почве, являются такие растительные ферменты, как дегалогеназа, оксидоредуктаза, нитроредуктаза, пероксидаза, лакказа, нитрилаза, медь-содержащая фенолоксидаза, которые могут функционировать за пределами растения и оказывать некоторое краткосрочное действие после его гибели. Важную роль в клетках растений играет конъюгация ксенобиотиков с метаболитами: пептидами, органическими кислотами, сахарами и другими соединениями клетки. Более 50 % ксенобиотиков могут находиться в вакуолях клетки в виде конъюгатов. Конъюгация повышает водорастворимость ксенобиотиков и обеспечивает их выход из организма (с корневыми выделениями, в результате испарения или включения в инертные вещества, в частности лигнин). Кроме аккумуляции и внутритканевого метаболизма растения могут стимулировать деградацию загрязнителей через свою корневую систему in situ, что является преимущественным механизмом элиминации органических поллютантов из загрязненной почвы.

Корневые выделения — главный инструмент растения в его ризосфере, воздействующий на загрязнитель как непосредственно, так и опосредованно. К непосредственному воздействию корневых выделений растения можно отнести солюблизацию, трансформацию и

127

деградацию загрязнителя под действием ферментов, выделяемых с экссудатами в ризосферу. Опосредованное участие корневых выделений растения в ризосферной деградации полллютанта заключается в стимулировании почвенных микроорганизмов-деструкторов путем увеличения их численности, обеспечения косубстратом и изменения физико-химических условий почвы для осуществления микробной и/или физико-химической деградации загрязнителя. Благодаря корневым экссудатам численность микробных популяций и их активность в 100 и более раз выше в ризосфере по сравнению с незасеянной почвой. Гипотетический механизм растительно-микробного взаимодействия при детоксикации ксенобиотика представлен на рис. 28.

Уровень почвы

Идентификация Изменение в корневой эксрастением токсиканта судации

Экссудат стимулирует микробное сообщество

Рис. 28. Возможный механизм взаимодействия растения-хозяина и ризосферного микробного сообщества, реализуемый в ходе детоксикации

ксенобиотика

Посев фиторемедиационных культур в загрязненные почвы имеет важное значение при применении технологии восстановления нарушенных биоценозов. В силу своего взаимовыгодного сосуществования растительно-микробные ассоциации обладают большими преимуществами при выживании в неблагоприятных условиях окружающей среды, при этом их выживание обусловлено не только повышением толерантности к ксенобиотикам, но и активным удалением токсикантов из сферы обитания.

Положительными факторами совместного использования растений и микроорганизмов для очистки почв от загрязнений являются:

128

•способность корневых систем растений создавать благоприятный воздушный режим в почве. Так, хорошо развитая корневая система злаков пронизывает верхние слои почвы и обеспечивает хорошую аэрацию ризосферы;

•фиксация атмосферного азота бобовыми растениями и перевод его в растворимые соединения устраняет дефицит подвижного азота, что характерно для нефтезагрязненных почв. Благодаря бобовым растениямпроисходитнакоплениеазотавпочвеиповышаетсяактивность углеводородокисляющей микробиоты;

•растения снабжают почву органическим веществом либо после своей гибели, либо при жизни за счет слущивающихся клеток корней

ивыделения различных биоактивных веществ (гормонов, ферментов), которые могут непосредственно разрушать загрязнитель или способствовать росту микроорганизмов-деструкторов.

Для фиторемедиации почв чаще используются растения — представители семейства злаковых и бобовых. Наиболее распространенные растения-фиторемедианты — люцерна, эспарцет, донник, костер, овсяница, райграс, мятлик, пырей, сорго, овес, рожь, кострец.

Технология фиторемедиации почвы, загрязненной нефтью,

складывается из нескольких этапов:

1.Оценка характера загрязнения участка (химический состав разлива, степень проникновения нефти в почву, картирование).

2.Разработка оптимальной схемы фиторемедиации (подбор видового состава растений, которые оптимальным образом подходят для устранения данного типа загрязнения и соответствуют данным почвенно-климатическим условиям; определение схемы посадки; выбор необходимых агротехнических мероприятий, в том числе оптимизация питания и химическая защита растений).

3.Выращивание растений (проведение комплекса агротехнических мероприятий, в том числе подготовка семенного материала, почвы, внесение минеральных удобрений, использование средств защиты).

4.Мониторинг участка (определение концентрации и распространения химических компонентов нефти, отслеживание путей ее биодеградации, проведение информационного анализа и прогнозирования).

Поглощение корнями с последующей аккумуляцией, а также метаболизм углеводородов в растении не являются решающими про-

129

цессами при фиторемедиации нефтезагрязненных почв. Предполагают, что в случае загрязнений почвы углеводородами основную роль в детоксикации играет микробиота ризосферы, а растения, адаптированные к условиям загрязнения, создают благоприятные условия для проявления ее деструктивной активности по отношению к загрязнителю, т. е. основным механизмом фиторемедиации почвы, загрязненной углеводородами, выступает ризодеградация.

Для очистки водных сред от загрязнителей широко используются такие макрофиты, как эйхорния (водяной гиацинт) (рис. 29), ряска, камыш озерный, рогоз узколистный и широколистный, тростник обыкновенный, рдест гребенчатый и курчавый, спироделла многокоренная, элодея, касатик желтый, сусак, стрелолист обычный, гречиха земноводная, резуха морская, уруть, хара, ирис и др. Из водорослейнашлиприменениевкачествеочистителейсточныхводвбиопру-

дах Chlorella (С.) pyrenoidosa, C. vulgaris, Scenedesmus quadricauda,

Ankistrodesmusbrauniiи др., которые способны разлагать фенолы, некоторые гербициды, цианиды и другие токсиканты. Известна способностьвысшихводныхрастенийудалятьизводыбиогенныеэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, марганец, серу), тяжелые металлы, фенолы, сульфаты, уменьшать загрязненность нефтепродуктами, синтетическими поверхностно-активными веществами. Поглощая значительное количество биогенных элементов, высшие водные растения снижают уровень эвтрофикации водоемов. Они усваивают и перерабатывают загрязнители, способствуя осаждению взвешенных и органических веществ, насыщают воду кислородом, создают благоприятные условия для нереста рыб, интенсифицируют очистку водыоттяжелыхметалловинефтепродуктовзасчетбактерий,активно размножающихся в биообрастаниях.

Во многих странах широко используются системы очистки шахтных и хозяйственно-бытовых сточных вод, загрязненного поверхностного стока, сточных вод предприятий легкой, металлургической, угольной промышленности, животноводческих комплексов с помощью высших водных растений (биопруды, биоплато, гидроботанические площадки). В условиях Сибири разработана аквасистема для очистки хозяйственно-фекальных стоков животноводческих комплексов и коммунальных хозяйств с помощью водного гиацинта. В результате экспериментов выявлены существенное снижение концентрации нефтепродуктов, сульфидов, фенолов в сточных водах

130