Карабинцева Фармацевтическая технология методички / Экологическая биотехнология

Целлюлоза является главной составной частью всякого растительного материала, и синтез ее по своим масштабам превосходит синтез всех других природных соединений. Сохраняющиеся в почве и возвращающиеся в нее растительные остатки на 40–70 % состоят из целлюлозы.

Целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнин, объединяясь в разных пропорциях, образуют лигноцеллюлозный материал, на долю которого приходится основная часть биомассы, остающейся в огромном количестве в виде отходов сельского хозяйства, деревообрабатывающей промышленности и других отраслей хозяйственной деятельности человека. Лигноцеллюлозные материалы можно разделить на три класса:

1.Сами растения, специально выращиваемые для получения целлюлозы, строительных материалов или корма для скота (хлопок, древесина, сено).

2.Растительные отходы, остающиеся после сбора и переработки урожая и после обработки древесины (солома, рисовая шелуха, древесная щепа, опилки и т. д.).

3.Бытовые отходы (использованные бумага, картон и т. д.).

В разложении (минерализации природных биополимеров) участвуют аэробные и анаэробные микроорганизмы-гидролитики, которые синтезируют ферменты, расщепляющие биополимеры до простых сахаров или жирных кислот (в ходе подготовительного метаболизма). Продукты гидролиза могут поступать в клетки гидролитиков и сопутствующих микроорганизмов и метаболизироваться до СО2 и

Н2ОРазложение. целлюлозы в аэробных условиях. В хорошо аэри-

руемых почвах целлюлозу разлагают и используют аэробные микроорганизмы (грибы, миксобактерии и другие эубактерии), а в анаэробных условиях — в основном клостридии. В аэробных условиях значительная роль в разложении целлюлозы принадлежит грибам. Они в этом отношении эффективнее бактерий, особенно в кислых почвах и при разложении целлюлозы, инкрустированной лигнином (древесины). Большую роль играют в этом процессе представители двух родов — Fusarium и Chaetomium. Целлюлозу расщепляют также

Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Trichoderma viride, Chaetomium globosum и Myrothecium verrucaria. Три послед-

них вида служат тест-организмами для выявления распада целлюло-

91

зы, а также при испытании средств, применяемых для пропитки различныхматериаловсцельюпредохранитьихотдействия микроорганизмов, разлагающих целлюлозу. Грибы образуют целлюлазы, которые можно выделить из мицелия и из питательной среды.

Cytophaga и Sporocytophaga — аэробные бактерии, разлагающие целлюлозу. Среди актиномицетов описано лишь немного целлюлозо-

разлагающих видов: Micromonospora chalcea, Streptomyces cellulosae,

Streptosporangium.

Целлюлолитическиеферментыпредставляютсобойсложныйвнеклеточный ферментативный комплекс, в который входят следующие ферменты:

•эндоглюканаза;

•экзоглюканаза;

•экзоглюкозидаза;

•целлобиаза.

Гидролизу целлюлозы предшествует адсорбция целлюлолитических ферментов на лигноцеллюлозном субстрате. Адсорбируемость ферментов зависит как от субстрата, так и от вида микроорганизмов. Этим обусловлены основные различия в скорости гидролиза целлюлозы целлюлолитическими комплексами. Наиболее адсорбируемые ферменты грибов Trichoderma viride и Trichoderma reesei, которые в качестве промышленных препаратов используют для гидролиза целлюлозосодержащего сырья.

Деструкция целлюлозы возможна и в результате окислительных биокаталитических реакций, протекающих с участием пероксида водорода. Эти реакции имеют большое значение при разрушении лигнина такими грибами белой гнили, как Phanerochaete chrysosporium. Аналогичные окислительные реакции выявлены и у других микроорганизмов, разлагающих целлюлозу: Polyporus adustus, Trichoderma viride, Myrothecium verrucaria.

Разложение целлюлозы в анаэробных условиях. В анаэробных условиях целлюлозу расщепляют чаще всего мезофильные и термофильные клостридии. Термофильный вид Clostridium thermocellum растет на простых синтетических средах, используя в качестве субстрата целлюлозу или целлобиозу, а в качестве источника азота — соли аммония; глюкозу и многие другие сахара эта бактерия не утилизирует. Продуктами сбраживания целлюлозы являются этанол, уксусная, муравьиная и молочная кислоты, молекулярный водород и

92

СО2. Вне клеток целлюлоза расщепляется, вероятно, только до целлобиозы. К сходным продуктам приводит сбраживание целлюлозы мезофильным видом Clostridium cellobioparum. Длинная палочка Bacillus dissolvens ведет себя подобно упомянутым выше видам Cytophaga:клеткиэтойбактериитесноприлегаюткволокнамцеллюлозы и не выделяют в среду целлюлазы.

Смешанные культуры микроорганизмов разлагают целлюлозу быстрее, чем монокультуры, что обусловлено ассимиляцией накапливаемых продуктов разложения и устранением их ингибирующего действия, а также образованием факторов роста или синергизмом ферментных систем симбионтов, например гемицеллюлаз целлюлолитического организма и систем сбраживания пентоз микроорганизма-симбионта. Поскольку расщепление целлюлозы с помощью целлюлолитических микроорганизмов происходит медленно и часто не до конца, в настоящее время активно ведутся работы по созданию с помощью генной инженерии микроорганизмов, обладающих более высокой целлюлазной активностью.

Лигнин разлагают микроорганизмы, относящиеся к лигнолитической группе. Лигнин практически не усваивается при пищеварении у высших животных; в природе его переработкой заняты различные грибы, насекомые, земляные черви и бактерии. Главную роль в этом процессе играют грибы-базидиомицеты. К ним относятся многие грибы, живущие как на живых, так и на мертвых деревьях, а также грибы, разлагающие листовой опад. Среди лигнинолитических грибов есть съедобные (опенок, вешенка, шампиньон).

Разрушающие древесину базидиомицеты можно разделить на две группы: 1) возбудители бурой гнили превращают древесину в красновато-коричневую массу; они разрушают главным образом целлюлозные и гемицеллюлозные компоненты древесины и не действуют на фенилпропановые полимеры; 2) возбудители белой гнили разрушают древесину с образованием почти белой массы; они действуют в первую очередь на лигнин и почти не затрагивают целлюлозу. К грибам, разрушающим прежде всего лигнин, относятся Polystictus versicolor и некоторые другие (например, Stereum hirsutum). Есть также грибы, действующие одновременно на лигнин и целлюлозу; та-

ковы Pleurotus ostreatus, Ganoderma applanatum, Polyporus adustus,

Armillaria mellea. Разрушение древесины чистыми культурами грибов происходит довольно медленно. Способностью к разложению

93

лигнина обладают также представители некоторых других родов

(Pholiota, Clitocybe, Lenzites, Panus, Poria, Trametes и др.).

Грибы белой гнили — единственная группа микроорганизмов, разлагающих все компоненты растительной массы, что обусловлено синтезом ими большого набора гидролитических и окислительных ферментов, а также высокой проникающей способностью мицелия в субстрат. Вначале грибы белой гнили разрушают лигноуглеводный комплекс, а затем — лигнин и целлюлозу. Грибы белой гнили деполимеризуют полисахариды до простых сахаров, в результате утилизации которых получают дополнительную энергию для расщепления более стойкого лигнина.

Из биодеструкторов лигнина помимо грибов белой гнили выделяют грибы, разлагающие лесную подстилку, в частности грибы-

базидиомицетыAgaricusbisporus(шампиньон),Coprinuscomatus(ко-

принус) (рис. 22), Stropharia (строфария) и др.

Рис. 22. Плодовые тела Coprinus comatus

(фотография предоставлена Т. В. Тепляковой)

Деградация полимерного лигнина происходит под воздействием внеклеточных ферментов — оксидоредуктаз грибов. К данным ферментам в первую очередь относятся лигнинолитические пероксидазы: лигнин-пероксидаза и Mn-пероксидаза, а также внеклеточная оксидаза — лакказа. Кроме того, лигнинолитичекий комплекс грибов

94

содержит вспомогательные ферменты, в первую очередь производящие перекись водорода для пероксидаз и активные формы кислорода. Сюда включают такие ферменты, как пиранозооксидаза, глюкозооксидаза, глиоксальоксидаза, целлобиозодегидрогеназа.

Частично разлагают лигнин и прокариоты: актиномицеты рода

Streptomyces, бактерии родов Acinetobacter, Aeromonas, Nocardia,

Pseudomonas. Эти микроорганизмы играют важную роль в деградации лигнина в нейтральной и щелочной зонах почвы, в которых лигнинолитические грибы не могут конкурировать с ними. Актиномицеты участвуют в деметилировании ароматических колец молекулы лигнина, окислении боковых цепей и расщеплении эфирных связей. Они переводят лигнин в растворимое состояние, но полностью его не минерализуют. Бактерии минерализуют лигнин в процессах соокисления, кометаболизма, в частности в присутствии глюкозы. Анаэробные микроорганизмы не разрушают лигнин, но анаэробные бактерии рода Clostridium способны трансформировать его алифатическую часть.

Основным продуктом разложения лигнина в природе является гумус. Декомпозиция лигнина в естественных условиях происходит в присутствии других элементов растительной ткани — целлюлозы и гемицеллюлозы. В оптимальных условиях некоторые смешанные культуры микроорганизмов расщепляют лигнин на 40–55 % через 15–20 сут. В аэротенке при очистке сточных вод, образующихся в производстве древесно-волокнистых плит, лигнин распадается в течение 3–5 сут.

Промышленный лигнин, например лигносульфонат, биодеградации поддается труднее. Лигносульфонаты — водорастворимые сульфопроизводные лигнина, образующиеся при сульфитном способе делигнификации древесины — представляют собой натриевые соли лигносульфоновых кислот с примесью редуцирующих и минеральных веществ. Лигносульфонаты имеют высокую поверхностную активность, что позволяет использовать их в качестве ПАВ в различных отраслях промышленности. Механизм разрушения технических лигнинов микроорганизмами, в особенности лигносульфонатов и гидролизного лигнина, сложен и до конца невыяснен.

Биодоступность лигнина можно повысить с помощью обработки его, например, озоном, пероксидом водорода или путем воздействия

95

жесткого излучения. Изучение биодеградации лигнинсодержащих материалов является актуальным в связи с поиском путей внедрения экологически безопасных биотехнологий в процессах делигнификации древесины, отбелки и очистки сточных вод.

5.2. Проблема создания биодеградируемых пластиков

В России ежегодно образуется около 180 млн м3 твердых бытовых отходов, половину которых составляет пищевая упаковка (бумага, металл, картон, стекло, полимерные материалы и т. д.). Из них только 3 % идет на повторную переработку, а остальные сжигаются или вывозятся на свалки. Однако сжигание — это дорогостоящий процесс, приводящий к образованию высокотоксичных, а также супертоксичных (таких как фураны и диоксины) соединений. Кроме того, под полигоны и свалки твердых бытовых отходов ежегодно отчуждается до 10 000 га земель, в том числе и плодородных, изымаемых из сельскохозяйственного оборота. Сроки, необходимые для разложения тароупаковочных материалов в естественных условиях, могут составлять несколько десятилетий.

Деструкторами полимерных соединений, синтетических тканей и пластиков являются прежде всего грибы с высокоактивными внеклеточными гидролазами, фосфатазами и другими ферментами

(Aspergillus, Penicillium, Trichoderma). Полимерные материалы, со-

держащие амидные и эфирные связи (капрон, нейлон, поролон), разрушаются под действием микробных протеиназ. Присутствие в полимерной молекуле простой эфирной связи облегчает расщепление и дальнейшее использование полимера плесневыми грибами. Первичная колонизация пластиков происходит в результате разрастания колоний грибов на поверхности, проникновения мицелия в толщу материала через микротрещины, а затем начинается агрессивное воздействие ферментов и выделяемых кислот на отдельные компоненты пластиков.

К числу полимерных смол, обладающих повышенной стойкостью к деструкции микромицетами и бактериями, относят полиэтилен, полипропилен, полистирол, жесткий поливинилхлорид, полиамид, полиэтилентерофталат. Менее стойки поливинилацетат, поливиниловый спирт, хлорсульфированный полиэтилен. Пластифика-

96

торы, входящие в состав пластиков, более подвержены биодеградации,таккакявляютсясмесьюэфировфталевойиадипиновойкислот. Основными деструкторами резины, пластиков и других полимерных соединенийвокислительныхусловияхможносчитатьмикроскопиче-

ские грибы родов Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Cladosporium,

Fusarium, а также бактерии родов Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter. В термофильных условиях некоторые синтетиче-

ские волокна разрушаются Bacillus subtilis, B. mycoides, Aerobacter aerogenes и некоторыми грибами. Есть данные, что в деградации высокомолекулярных полиэтиленов и нейлонов принимают участие грибы, вызывающие белую гниль (Phanerochaete chrysosporium,

Trametes versicolor). С помощью ферментного комплекса, гидролизующего лигнин, эти микроорганизмы способны разлагать такие полимеры до растворимых олигомеров в условиях лимитации по углероду и азоту.

О процессах биоразрушения полимеров-ксенобиотиков в анаэробных условиях сведений нет. Только полимеры природного происхождения — полигидроксиалканоаты — могут разлагаться микробными сообществами анаэробных илов очистных сооружений.

Разложение традиционных полимерных материалов продолжается десятки и сотни лет, использование же биополимеров приводит к значительному сокращению этих сроков. Термин «биополимеры» включает в себя широкую гамму полимеров, способных при соответствующих условиях разлагаться на безвредные для природы компоненты. Основная идея получения биоразлагаемых пластиков — повторить природные «циклы развития». В их производстве используются обновляемые ресурсы, т. е. вещества, образующиеся в растениях в процессе фотосинтеза. После использования такие материалы могут быть превращены в компост и с помощью микроорганизмов или других природных факторов переработаны в начальные продукты — воду и диоксид углерода. Материалы из биоразлагаемых полимеров по основным свойствам сходны с традиционными пластиками, однако имеют другие технические характеристики и возможности применения благодаря своей особой химической структуре.

Скорость разложения биополимерных материалов зависит от ряда факторов — вида полимера, влажности, температуры, светового воздействия, микробиологической популяции и др. Наиболее высокой способностью к биодеструкции обладают те природные и синтетиче-

97

ские полимеры, которые содержат химические связи, легко подвергаемые гидролизу. Присутствие заместителей в полимерной цепи часто способствует повышению биодеструкции, зависящей также от степени замещения цепи и длины ее участков между функциональными группами, гибкости макромолекул и т. д.

Следующий фактор, влияющий на стойкость полимеров к биоразложению, — величина их молекул. В то время как мономеры или олигомеры могут легко поражаться микроорганизмами, биополимеры с большой молекулярной массой более устойчивы к их воздействию. Биодеструкцию большинства технических полимеров инициируют процессы небиологического характера, такие как термическое и фотоокисление, термолиз, механическая деградация и т. п. На биодеградацию синтетических полимеров существенно влияет их надмолекулярная структура. Известно, что компактное расположение структурных фрагментов полукристаллических и кристаллических полимеров ограничивает их набухание в воде и препятствует проникновению ферментов в полимерную матрицу. Это затрудняет воздействие ферментов микроорганизмов не только на главную углеродную цепь полимера, но и на биоразрушаемые участки цепи. Кроме того, аморфная часть полимера всегда менее устойчива к биодеструкции, чем кристаллическая.

Современные биополимеры могут быть получены как из возобновляемых природных ресурсов, так и из традиционного сырья — продуктов нефтехимии. В настоящее время в пищевой промышленности широкое распространение получили пленки на основе таких природных биоразлагаемых полимеров, как целлюлоза, хитозан, желатин, полипептиды, казеин и др. Особый интерес вызывает крахмал как наиболее дешевый вид сырья, основным источником промышленного производства которого служат картофель, пшеница, кукуруза, рис, маис и некоторые другие растения.

Например, голландская компания Rodenburg Polymers уже производит биополимеры марки Solanyl на основе крахмала. Сначала их производили из отходов кукурузы, а позднее — из отходов картофеля. По своим физико-механическим характеристикам они близки к полипропилену (ПП) и полистиролу (ПС). В компосте этот биополимер разлагается менее чем за 12 нед, причем время его полного разложения зависит от состава и технологии получения, а также от условий окружающей среды. Во влажной среде при контакте с бактериями или грибками крахмал набухает, избирательно гидролизуется и

98

увеличивает площадь поверхности всего полимера. Поверхность покрывается крахмальной камедью и глюкозой, присутствие которых способствует образованию перекисей, вызывающих деструкцию полимерных молекул. Образующиеся молекулы с короткой цепью могут ассимилироваться микроорганизмами почвы.

Термопластичные смеси синтетического полимера с крахмалом получают, используя крахмал, пластифицированный глицерином и водой. Смешение компонентов осуществляют в экструдере при температуре около 150 °С, которая обеспечивает хорошую желатинизацию крахмала. Биоразложению материала способствует использование добавок малых количеств прооксидантов, усиливающих биодеградацию за счет окислительного разложения материала в естественных условиях. Примером такой смеси может служить композиция, в состав которой входит полиэтилен, крахмал и растительное масло. Последнее облегчает смешение синтетического и природного полимера при формовании и одновременно играет роль прооксиданта.

Из биоразлагаемой композиции, содержащей 69,8 % полиэтилена (ПЭ), 30 % крахмала и 0,2 % вспенивающего агента, методом формования или раздува получают контейнеры, мешки, различные чашки, подошвы обуви, сумки и т. п.

Экструзией смесей кукурузного крахмала, микрокристаллической целлюлозы и метилцеллюлозы с добавками пластификаторов (полиолов) или без них получают съедобные пленки, предназначенные для защиты пищевых продуктов от потери массы (за счет снижения скорости испарения влаги). Такие пленки, создавая определенный барьер проникновению кислорода и других веществ извне, замедляют процессы порчи пищевых продуктов.

Разработан процесс получения пленок из полиэтилена высокого давления и полипропилена, содержащих до 30 % полигидроксибутирата, который получают из дешевого сырья — мелассы, являющегося отходом процесса производства сахара. Такие пленки, достаточно прочные и эластичные, разлагаются в почве примерно за 6 мес. Повысить величину биодеструкции пленок из полиэтилена можно путем введения в полимер 10–30 массовых % полиэфира.

В качестве наполнителей для создания биоразлагаемых материалов на основе полиолефинов, в том числе вторичных, термопластичных эластомеров и полиуретана также могут быть применены растительные волокона (волокна льна, пеньки, отходы производства льняной нити, волокна из эфиров целлюлозы).

99