Преципитирующие сыворотки

Преципитирующие сыворотки получают иммунизацией кроликов убитыми микроорганизмами, антигенами бактерий, экстрактами микробов и т. п. Иммунизация проводится длительно в течение нескольких месяцев по определенным схемам. По одной из схем иммунизацию начинают со 100 млн. бактериальных клеток в 1 мл, увеличивая дозу в 2 раза, заканчивая введением 10—20 млрд. в 1 мл, проводя 10—12 инъекций с интервалом в 4—6 дней.

Титром преципитирующей сыворотки называется то максимальное разведение антигена, которое преципитируется цельной сывороткой. Сыворотки выпускают с титром не меньше 1 : 100000. Это связано с тем, что антиген, определяемый в реакции преципитации, имеет микроскопическую величину и в единице объема его может содержаться больше, чем в таком же объеме антител.

Специфические преципитирующие сыворотки применяются при диагностике инфекционных заболеваний (менингит, сибирская язва, чума, туляремия, полиомиелит и др.); в судебно-медицинской практике для определения видовой принадлежности белка крови; в санитарной практике для обнаружения соответствующих белковых веществ в продуктах (при подозрении на фальсификацию).

Реакция преципитации может быть поставлена в виде кольцепреципитации или реакции преципитации в геле, последняя дает возможность изучать тонкую антигенную структуру бактерий и вирусов.

Гемолитическая сыворотка

Гемолитическую сыворотку получают путем 3—4-кратной иммунизации кроликов взвесью эритроцитов барана с интервалом в 2—3 дня. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, которое в объеме 0,5 мл в присутствии комплемента вызывает гемолиз 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов барана в течение часа при температуре 37°С. Титр должен быть не ниже 1 :1200—1 : 1500.

Гемолитическая сыворотка применяется в реакции связывания комплемента (РСК) в индикаторной системе (гемолитическая сыворотка-(-эритроциты барана).

Противовирусные сыворотки

Иммунные противовирусные сыворотки, применяющиеся при идентификации вирусов, получают от различных животных в зависимости от вида вируса.

Так, например, сыворотку против вируса вакцины, оспы и аденовирусов получают иммунизацией соответствующими вирусами кроликов; против вируса гриппа — белых хорьков, крыс, кур, мышей; против вируса кори — морских свинок и т. п.

В некоторых случаях предпочтительнее сыворотка реконвалесцентов, например, при диагностике полиомиелита, хотя против каждого отдельного типа вируса сыворотки можно получить иммунизацией обезьян.

Необходимость строгого выбора животного для получения иммунных сывороток связана с учетом содержания в лих неспецифических ингибиторов, которые подавляют активность вирусов и неспецифических агглютининов.

Поэтому перед проведением реакций обязательно освобождают иммунные сыворотки от термолабильных (прогреванием при 56°С — 30 мин.) и термостабильных (ферментированием, обработкой углекислотой и др. методами в зависимости от вида вируса) ингибиторов и проверяют на наличие неспецифических агглютининов.

Иммунные диагностические противовирусные сыворотки применяются для определения вида или типа вируса в реакциях торможения гемагглютинации (РТГА), связывания комплемента (РСК), реакции нейтрализации на лабораторных животных, в культурах клеток и развивающихся куриных эмбрионах.

Люминесцирующие сыворотки

Люминесцирующие сыворотки представляют собой иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченные флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующих сывороток проводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной сыворотки различных флюорохромов путем прочной химической связи.

Микроорганизмы, обработанные люминесцирующими сыворотками, приобретают способность светиться при просмотре препаратов с помощью люминесцентных микроскопов (МЛ-I, МЛ-2, МЛ-3, МЛД-1). Для маркирования антител люминесцирующих сывороток чаще всего применяется изотиоцианат флюоресцеина, дающий ярко-зеленое свечение по периферии клеток с характерной для данного вида бактерий морфологией; реже — различные производные родамина, которые придают оранжево-красное свечение.

Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии несложно: исследуемую взвесь, содержащую микроорганизмы, наносят на предметное стекло, высушивают, фиксируют в жидком фиксаторе (этанол, ацетон и др.), окрашивают люминесцирующей сывороткой в течение времени, указанного на этикетке ампулы с сывороткой. Просматривают препараты в падающем свете люминесцентного микроскопа с иммерсионной системой.

Интенсивность свечения оценивается по четырехплюсовой системе:

+ + + +—очень яркое свечение по периферии бактерий, контрастируемое с темным телом микроорганизма;

+ + +—яркая флюоресценция периферии изучаемого микроорганизма;

+ + или

+—слабое свечение периферии клетки, не контрастируемое с телом бактерии.

Метод люминесцентной микроскопии широко используется с диагностической целью — для выявления патогенных микроорганизмов в патологическом материале от больного, обнаружения бактерий непосредственно в объектах внешней среды (воды, смывы, почвы и т. д.), а также при определении и титровании антител в сыворотке больных.

Люминесцентно-серологический метод (метод Кунса) для выявления микроорганизмов и антител используется в 2 модификациях: прямой и непрямой метод.

1. Прямой метод заключается в том, что исследуемый препарат обрабатывается люминесцентной сывороткой, специфической в отношении изучаемого микроорганизма. В результате образуется флюоресцирующий комплекс антиген — антитело.

В настоящее время выпускаются Люминесцирующие сыворотки: колиэнтеритные, брюшнотифозные, паратифозные А и В, дизентерийные Флекснера и Зонне, холерная, бруцеллезная, туляремийная, сибиреязвенная, чумная.

2. Непрямой метод может быть использован как для вы явления бактерий, так и определения антител. Сущность непрямого метода состоит в том, что сначала проводится обычная иммунная реакция между антигенами и специфическими к ним антителами, затем этот комплекс обрабатывается люминесцирующей антисывороткой, специфичность антител которой направлена против белков сыворотки того вида животного, от которого получена иммунная сыворотка. Результатом является флюоресцирующий комплекс: антиген — антитело — антиантитело. Для постановки непрямого метода выпускаются люминесцирующие сыворотки против глобулинов кролика, человека, лошади и др.

Этот метод имеет определенное преимущество перед прямым, так как является в 10—12 раз более чувствительным и для его постановки можно в лаборатории иметь ограниченный набор люминесцирующих сывороток.

Следует подчеркнуть те несомненные преимущества метода люминесцирующих антител, благодаря которым в настоящее время он широко применяется в практике. Во-первых, реакция позволяет наблюдать соединение антигена бактерий с антителами буквально на одной особи и, следовательно, характеризуется высокой чувствительностью, во-вторых, реакция является универсальной (так как может использоваться для обнаружения бактерий, вирусов, риккетсий и их растворимых антигенов), и в-третьих, реакция характеризуется простотой приготовления препаратов и быстрым получением ответа, и, наконец, позволяет исследовать не только живые, но и погибшие микроорганизмы.

Люминесцентная микроскопия используется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.