II. Хта отдельных опиатов.

Объекты ХТА – у живого лица - моча, кровь, рвотные массы, промывные воды, волосы, слюна, пот, меконий новорожденных

У трупа - моча, кровь, желудок и кишечник (толстый и тонкий) с содержимым, почка, головной и спинной мозг, печень с желчным пузырем, селезенка, легкие, подкожно-жировая клетчатка в области инъекции, жидкость из перикарда, стекловидное тело глаза. При отсутствии образцов крови рекомендуется ткань мышцы бедра. Эта ткань устойчива к бактериальной инвазии и характеризуется слабой диффузией морфина в период после смерти.

Допускается консервирование внутренних органов формалином в течение 7 сут, опиаты дольше всего сохраняются в печени.

ИЗОЛИРОВАНИЕ.

Изолирование опийных Ал из биоматериала производится подкисленным спиртом или водой с последующей экстракцией орг.растворителем из щелочной вытяжки. При этом оба метода приводят к потерям морфина, достигающим при извлечении хлороформом 97-98,5%. Учет рН среды в процессе изолирования и экстрагирования Ал (метод Крамаренко) позволяет обнаружить в 2 раза больше морфина. Из водных р-ров морфин экстрагируется изоамиловым спиртом (73-76% при рН 8,5-9,5); хлороформом ( ~28-30% при рН 8,6-10,2).

Тебаин в значительном кол-ве экстрагируется и из кислой среды. Дионин (99%) извлекается из щелочных водных р-ров при трехкратном экстрагировании хлороформом.

1. Экспресс-метод изолирования морфина из мочи и крови разработан А.Ф. Рубцовым и Е.М.Соломатиным в НИИ суд.медицины МЗ СССР , и позволяет извлекать 83% морфина из крови и 71,3% из мочи.

Изолирование опиатов из мочи проводят в 2 этапа: 1) Выделение свободных морфина, кодеина, героина и 6-МАМ путем прямой экстракции 10 мл мочи при рН 9,0 (карбонатный буфер, рН 9,4) с помощью 50 мл смеси хлороформ-н-бутанол (9:1); 2) Выделение общего морфина и общего кодеина (высвобождение из конъюгатов с глюкуроновой кислотой) после предварительного кислотного гидролиза 10 мл мочи с 2 мл конц.НСl на кипящей водяной бане 30 мин, с последующей экстракцией смесью хлороформ-н-бутанол (9:1).

Методика. 5 мл крови или мочи смешивают с 8 мл 40% Na₂S + HCl (15% - для крови и конц. - для мочи) до 10% ее содержания. Смесь нагревают на кипящей водяной бане 30 мин, а затем охлаждают до комн.tº. Для очистки и отделения Ал опия oт белков к жидкости + 50% ТХУ до 7% концентрации. После осаждения белков через 5-10 мин надосадочную жидкость насыщают кристаллическим NaHCO₃ (на 30 мл, 5 мин). Бутанольно-хлороформные извлечения из объектов фильтруются через бумажный фильтр с безводным Na₂SO₄. Фильтрат выпаривают в 2 чашках не выше 40°С. Другой споосб гкислотно гидролиза мочи: 5 мл мочи + 0,5 мл 11,6М НС1, при 120С 15 мин при ~ 1 атм. Гидролиз мочи м.б. с примнеением фермента β-глюкуронидазы.

Очистка и концентрирование. Очистку аликвот полученных экстрактов (эквивалентных 2 мл мочи) проводили реэкстракцией в 0,5 М НС1 (6 мл), затем после отделения водной фазы и доведения ее до рН 9,0 (карбонатный буфер) экстрагировали ее смесью хлороформ-н-бутанол (9:1) по 10 мл 2 раза.

Л. М. Власенко для улучшения результатов ХТА на морфин применила хроматографический метод выделения его на колонке катионита СДВ-3 и КУ-2 в Н-форме. Через колонку пропускают водное извлечение из биоматериала, подкисленное щавелевой кислотой до рН 5-6. Десорбция производится 5% аммиаком. Чув-сть обнаружения увеличивается в 7,5-12,5 раз при использовании смолы СДВ-3 и в 3-5 раз - смолы КУ-2.

2. Кодеин в отличие от морфина экстрагируется орг.растворителем (эфиром) из водных р-ров, подщелоченных NaOH (pH=8,0-8,5), что используется для отличия и отделения морфина от кодеина. Морфин не экстрагируется и образует морфинат.

Методика изолирования кодеина из мочи. В делительной воронке 50 мл мочи, подщелаченной р-ром аммиака до рН=10, взбалтывают 5 мин с 50 мл хлороформа. Хлороформную вытяжку отделяют от водной фазы, взбалтывают с 3 мл воды 3 мин. Водную фазу отделяют от хлороформа, фильтруют через безводный Na₂SO₄ и выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл этанола и исследуют.

Из трупного материала героин нативный практически не изолируется (гидролизуется при изолировании).

Пробоподготовка для метода ВЭЖХ. Одним из основных этапов проведения анализа в-в в различных объектах методом ВЭЖХ является подготовка проб, включающая в себя предварительную экстракцию их орг.растворителями или смесью с водой, очистку с последующим растворением остатка в растворителе или подвижной фазе.

Подготовка проб биообъектов предусматривала экстракцию в-в из щелочного р-ра различными растворителями или их смесью: смесью эфир-пентан, бутанол-третбутиловый эфир, хлороформ-пропанол, хлороформ-изопропанол. Экстракции предшествовала депротеинизация с помощью ацетонитрила, гидролиз кислотный и ферментативный.

Для очистки извлечений использовали центрифугирование, предколонку с различными сорбентами с последующим элюированием орг.растворителями, получением остатка и растворением его в подвижной фазе или в соответ.растворителях. Предложена реэкстракция фосфатным буфером или фосфорной кислотой с последующим анализом водной фазы.

КАЧЕСТВЕННОЕ ОБНАРУЖЕНИЕ.

1. Микроскристаллические реакции. Методика: Сухой остаток на предметном стекле растворяют в капле 0,1 н HCl и + капли реагента.

С общеалкалоидными реактивами морфин и кодеин дают осадки, чаще всего аморфные, редко кристаллические.

Морфин: С общеалкалоидными реактивами дает осадки, чаще всего аморфные, редко кристаллические.

1. Р-р йода в KI (реактив Вагнера) в присутствии НСl дает характерный кристаллич. осадок - сростки из прямоугольных пластинок красно-оранжевого цвета. Чув-сть реакции 0,03мг. Осадки др. структуры дают атропин, бруцин, гидрастинин, кофеин, пилокарпин, скополамин, стрихнин, тропакокаин, физостигмин, хинин и некоторые др.в-ва.

2. С йодидом кадмия (10%) дает белый осадок, состоящий из бесцветных игл, собранных в пучки. Чув-сть 2.5 мкг.

3. С хлоридом окисной ртути (5%) - характерные пучки из игл.

4. С солью Рейнеке образует сиреневые кристаллы в виде густых сростков из пучков тонких игл. Чув-сть 2 мкг.

Кодеин: 1. С общеалкалоидными реактивами дает осадки, чаще всего аморфные, редко кристаллические. 2. С р-ром пикролоновой кислоты образуется желтый аморфный осадок, который при стоянии становится кристаллическим. Наблюдаются кристаллы 2 видов: желтые сфероиды и пучки из иглообразных и пластинчатых кристаллов. Чув-сть 13 мкг.

Дионин: С хлоридом окисной ртути (5%) выпадает осадок из тонких бесцветных пластинок и удлиненных призм с двухсторонними концевыми гранями. При протирании предметного стекла на месте капель тотчас образуются характерные пучки из игл.

Героин нативный дает с гексахлороплатиновой кислотой характерный кристаллический осадок из желтых игл, собранных в сфероиды. Чув-сть - 0,07-0,05 мг героина в пробе.

2. Цветные реакции. Методика: Несколько кап исследуемого хлороформного р-ра в 5 фарфоровых чашках или пластинках выпаривают при комн.tº досуха. К сухим остаткам + по 1 кап реактивов.

Основные цветные реакции опиатов и их чу-всть приведены в таблице 1.

Таблица 1. Цветные реакции на опиаты.

Реактив	Морфин	Кодеин	Героин	Апоморфин	Дионин	Наркотин	Папаверин
1. Реактив Марки: конц.H2SO4+формальдегид	Красно-фиолетовое окрашивание (до 0,05 мкг)	Фиолетовое окрашивание (до 0,05 мкг)	Красно-фиолетовое окрашивание (до 0,05 мкг)	фиолетовое быстро  грязно-зеленое (0,1 мкг)	зеленое  синее  сине-фиолетовое	Фиолетовое  зеленое и желтое окрашивание	фиолетовое
2. Реактив Фреде: конц.H2SO4+молибденовая кислота	Фиолетовое окрашивание  бледно-розовое (0,05 мкг)	Cиняя  зеленая (0,05 мкг в пробе по Драгендорфу и 0,1 мкг по Кларку)	Красно-фиолетовое окрашивание (до 0,05 мкг)	грязно-зеленое (0,1 мкг), при окислении на воздухе - слабо-фиолетовая окраска	Зелено-синее	Синевато-зеленое  вишнево-красное окрашивание	Сине-зеленое
3.Реактив Манделина		Грязно-зеленая  синяя
4. Конц. HNO3	кроваво-красная  желтая	желтая
5. Реактив Эрдмана конц.H2SO4 +конц. HNO3	Желтая окраска	нет окраски, при нагревании синяя				Красная окраска
6. Реакция Пеллагри	+	+	+	+	+

I. Реакция Пеллагри на апоморфин. При нагревании морфина, кодеина, дионина, героина с конц. HCl и H₂SO₄ они превращаются в апоморфин.

Методика получения апоморфина. Сухой остаток растворяют в 1-2 кап конц. HCl в пробирке, вносят 1-2 кап конц. H₂SO₄ и смесь нагревают на водяной бане до полного выпаривания HCl и еще 15 мин. Охлаждают и вносят 2-3 мл воды. Если при этом образуются осадок, то его растворяют в нескольких мл разбав. HCl. Полученный р-р нейтрализуют (слабо подщелачивают) 10% Na₂CO₃.

Методика реакции Пеллагри. К полученному р-ру апоморфина осторожно (по каплям) вносят спиртовый р-р йода (йодную настойку), появляется зеленая окраска. Далее добавляют 0,5-1,0 мл диэтилового эфира и взбалтывают, водный слой сохраняет зеленую окраску, а эфирный - приобретает пурпурно-красную окраску. Избыток йода мешает этой реакции, т.к. его окраска маскирует окраску конечного продукта реакции.

II. Специфические цветные реакции на отдельные опиаты

1. Специфические цветные реакции на морфин. Вследствие наличия спиртового гидроксила морфин обладает восстанавливающей способностью. Эти реакции применяют для обнаружения морфина в лек.смесях и в хорошо очищенных вытяжках из биоматериала, т.к. ложноположительный результат дают некоторые примеси, которые из биоматериала переходят в вытяжки. Кодеин, дионин и героин в отличие от морфина не дают этих реакций.

1. С FeCl₃ морфин дает синюю окраску. К сухому остатку хлороформной вытяжки (или к нейтральному р-ру) + 1-2 кап свежеприготовленного 2% FeCl₃. После кислотного гидролиза р-ра кодеина (20 мг) в 5 мл конц. H₂SO₄ + 2 кап 5% FeCl₃, нагревают 1 мин на водяной бане, появляется синяя окраска, + 1 кап HNO₃ - окраска меняется на ярко-красную.

2. Реакция с гексацианоферратом калия и FeCl₃ основана на том, что гексацианоферрат калия (III) окисляет морфин и превращается в гексацианоферрат калия (II), который взаимодействует с FeCl₃ с образованием берлинская лазурь. Эту реакцию м. выполнить также с водным р-ром исследуемого в-ва.

3. Реакция с йодноватой кислотой. При взбалтывании р-ра морфина, подкисленного H₂SO₄, с р-ром йодноватой кислоты или р-ром йодата калия, не содержащего йодидов, выделяется свободный йод, который при взбалтывании с хлороформом переходит в хлороформный слой, окрашивая его в фиолетовый цвет.

4. Морфин дает флюоресцирующий продукт голубого цвета с аммиачным р-ром ферри-ферроцианида калия. 6-МАМ ( 0,3-0,5 мкг) образует димер при окислении феррицианидом калия в щелочной среде и смешанный димер с морфином, которые дают желто-сероватое свечение

2. Специфические цветные реакции на кодеин и дионин.

1. С реактивом Либермана– черное окрашивание;

2. Реакция с арсенатом калия синяя окраска. Алкалоид растирают с реактивом (1:1) и несколькими каплями H₂SO₄.

3. Реакция с сахаром в присутствии H₂SO₄ – красная окраска. Несколько мг кодеина растирают с сахаром и нагревают смесь с H₂SO₄.

3. Специфические реакции на героин. Под влиянием щелочей или конц. H₂SO₄, при нагревании с водой героин легко гидролизуется на морфин и уксусную кислоту, благодаря чему при ХТА после извлечения подкисленной водой или спиртом обнаруживается продукт его гидролиза - морфин. Поэтому героин дает все реакции морфина.

1. При исследовании нативного героина после реакций, общих с морфином, проводят реакцию на уксусную кислоту: героин растворяют в спирте, + конц. H₂SO₄, и смесь нагревают на водяной бане; ощущается запах этилацетата. 2. Пробу с р-ром феррицианида калия и сульфата меди (по Kambe и соавт.).

Для отличия нативного героина от морфина м. служить реакция, в которой участвует свободный фенольный гидроксил морфина (см.выше). Для отличия героина от кодеина м. служить отношение его к реактиву Манделина и Фреде (См. таблицу 1).

4. Специфические цветные реакции на апоморфин. В процессе изолирования опиатов окраска хлороформного извлечения в зеленый или грязно-зеленый цвет является основанием для исследования на наличие апоморфина. ХТА м. производиться и при спец. заданиях.

Апоморфин с FeCl₃ дает розово-красное окрашивание, быстро переходящее в фиолетовое, а затем в черное.

3. ТСХ-анализ опиатов. Для подтверждения результатов цветных реакций необходимо провести ТСХ испытуемого р-ра. Анализ мочи и крови на опиаты методом ТСХ широко используется в практике ХТА лаб-рий. При проведении СМЭ трупов в настоящее время приоритет отдают методу ТСХ, экономически выгодному, хотя и менее чувствительному и специфичному. Способ ТСХ-анализа (с учетом его возможностей) может оказать существенную помощь при ХТА мочи на опиаты и в определенных интервалах концентраций м. быть применен в комбинации с др. методами анализа, такими как ГЖХ, ВЭЖХ и ГХ-МС.

Представлены результаты изучения и оценки ряда описанных в литературе и применяемых на практике систем растворителей и реактивов детектирования для идентификации опиатов (морфина, кодеина, героина и его знакового метаболита 6-МАМ) в экстрактах из мочи трупов и живых лиц, из их гидролизатов с использованием ТСХ-пластинок сорбфил ПТСХ-ПА (ЗАО"Сорбполимер"). Использование методики изолирования опиатов из мочи, включающей раздельное выделение, с одной стороны, свободных морфина, кодеина, героина и 6-МАМ при прямой экстракции, с другой - общих морфина и кодеина после кислотного гидролиза определило поиск и выбор условий ТСХ-анализа - систем растворителей, ориентированных преимущественно на разделение 4-компонентной смеси морфин-кодеин-героин-6-МАМ и 2-компонентной смеси кодеин-морфин.

Существует множество вариантов обнаружения опиатов методом ТСХ. При использовании пластинок с силикагелем лучшие результаты по разделению смесей опиатов (морфин, кодеин, героин, тебаин, папаверин, этилморфин, наркотин) обеспечивают 2- и 3-компонентные системы растворителей основного характера (с добавлением водного аммиака, диэтиламина) на основе толуола, этилацетата, ацетонитрила, циклогексана, диоксада с добавлением метанола, этанола, ацетона и др., описанные как специально для анализа опиатов, так и включенных в число унифицированных систем растворителей для ХТА ТСХ-скрининга лек.в-в основного характера. При ТСХ-скрининге опиатов обязательно добавление щелочных агентов (диэтиламин, аммиак) для устранения взаимодействия ионнообменного взаимодействия. В работе N.Nair и соавт. проведена оценка 35 систем растворителей, предложенных разными авторами для ТСХ-анализа 8 опийных Ал (морфина, кодеина, ацетилкодеина, папаверина, тебаина, носкапина, героина и 6-МАМ) и потенциальных фальсифицирующих в-в, встречающихся в составе "уличного" героина (кокаина, метадона, эфедрина, хинина). Состав хроматографических систем, выбранных для изучения, их оценка с учетом разрешения R представлены в табл. 2.

Таблица 2. Значения величин Rf смесей опиатов на пластинках сорбфил ПТСХ-ПА в различных системах ТСХ.

Хроматографические системы	Разделяемые соединения
	Героин-6-МАМ	Героин-кодеин	6-МАМ-кодеин	Кодеин-морфин	Кодеин
1 – толуол-ацетон-этанол-25% NH3•Н2О (45:45:7:3);	1,41	1,79	1,07	1,71	0,4 (Merk)
2 – этилацетат-метанол-25% NH3•Н2О (85:30:10 или 17:6:2);	0,50	1,81	1,46	1,69
3 – этилацетат-абс.этанол-25% NН3•Н2О (90:30:10 или 18:6:2); или 4 – этилацетат-метанол- 25%NН3•Н2О (17:2:1)	0,66 1,14	2,00 2,00	1,82 1,50	2,00 1,69
5 - этилацетат-абс. этанол-25%NН3•Н2О (85:10:5 или 17:2:1);	1,14	1,86	1,39	1,71
6 – этилацетат-абс.этанол-25% NН3•Н2О (85:10:15 или 17:2:3);	1,00	1,85	1,57	2,30
7 – ацетонитрил-бензол-этилацетат-25% NН3•Н2О (40:30:25:4);	1,49	1,88	1,00	1,33
8 – ацетонитрил-хлороформ-этилацетат-25% NН3•Н2О (8:6:5:1);	1,82	2,93	2,16	2,36
9 – диоксан-хлороформ-этилацетат-25% NН3•Н2О (60:25:10:5);	0,93	1,50	0,96	1,60
10 - этилацетат-циклогексан-абс.этанол-25% NН3•Н2О (70:15:10:5)	1,00	2,25	1,50	2,00
11. эфир-ацетон-25% аммиак (40:20:2)					0,18
12. метанол-аммиак (100:1,5)					0,33 (Siluf.)
13. хлороформ-метанол (90:10)					0,37 (Merk)
14. бензол-этанол-три(ди)этиламин (9:1:1)					0,46(Сорб) 0,34(Сил)
15. гексан-хлороформ-диэтиламин (9:9:4)					0,17(Сорб) 0,16(Сил.)

Смесь веществ разделяется в ТСХ-системе удовлетворительно, если Rf>1,5. Как видно из табл. 2, наиболее сложной для разделения парой при ТСХ-анализе является героин-6-МАМ. Наиболее эффективной является система 8 и, в меньшей степени, система 1. Во всех остальных системах растворителей героин и 6-МАМ образуют одну зону. Морфин-кодеин-героин в системах 1-4, 6, 7, 9, 10 разделяются удовлетворительно.

При проведении и интерпретации результатов ТСХ-анализа кстрактов из мочи и ее гидролизатов на опиаты следует учитывать следующие факторы.

1. Наличие в экстракте мочи примесных веществ, например лекарств, компонентов табака, экстрактивных веществ из мочи.

Для ТСХ-анализа из числа представленных систем растворителей были выбраны системы 1, 4 и 8, различающиеся по своей полярности.

В табл. 3 приведены данные по хроматографическому поведению в-в, встречающихся при ХТА в связи с анализом на группу опиатов.

Так, совместно с опиатами часто выявляется опиоидный анальгетик трамадол, который в системах 1 и 4, выделяется от опиатов, однако обнаружению их при этом м. мешать многочисленные метаболиты трамадола. Никотин и его метаболиты часто встречаются при экспертизах отравлений наркотиками у курящих и м. мешать обнаружению героина (н-р, котинин, никотин), морфина и кодеина (н-р, норникотин).

Экстрактивные в-ва из мочи и ее гидролизатов при разделении в системах 1, 4 и 8 распределяются по всему полю хроматограммы, попадая частично и в зоны опиатов. При приграничных концентрациях морфина и кодеина экстрактивные в-ва в этих зонах м. оказывать помехи при выявлении морфина и кодеина. Однако их влияние сводится к минимуму при использовании для анализа оптимальных аликвот экстрактов из мочи и ее гидролизатов и применении соответ. цветных реакций.

Таблица 3. Величины Rf опиатов, некоторых наркотиков и лекаррств при разделении их методом ТСХ на пластинках сорбфил ПТСХ-АП.

2. Кратность хроматографирования в одной системе.

Показано, что в одной и той же камере, в одном и том же объеме системы растворителей без потери эффективности разделения хроматографирование м. проводить не более 2 раз. Это связано с потерей 25% аммиака при многократном хроматографировании. Такая ошибка иногда происходит в практических лаб-риях при использовании системы растворителей без ее замены в камере при хроматографировании нескольких пластинок.

3. Вид растворителя, с помощью которого осуществляется перенесение сухого остатка экстракта мочи на стартовую линию, влияет на чув-сть определения морфина. В практических лаб-риях для этой цели нередко используют хлороформ, в котором морфин плохо растворяется. Наиболее полно опиаты растворяются с помощью смесей растворителей: метанол-хлороформ (9:1), абс.этанол-хлороформ (9:1). бутанол-хлороформ (1:9).

Разделяемые соединения	Системы
	8	1	4
Героин	0,41	0,53	0,73
6-МАМ	0,30	0,48	0,72
Кодеин	0,22	0,36	0,60
Морфин	0,08	0,23	0,34
Наркотин (носкапин)	0,73	0,70	0,86
Нарцеин	0	0	0,08
Папаверин	0,64	0,59	0,81
Промедол	0,55	0,58	0,81
Трамадол	0,61	0,77	0,85
Бензофенон диазепама	0,77	0,75	0,83
Диазепам	0,68	0,69	0,81
Димедрол	0,60	0,60	0,85
Кокаин	0,70	0,73	0,81
Кофеин	0,48	0,49	0,57
Никотин*	0,45	0,52	0,80
норникотин	0,23	0,18	0,46
котинин	0,45	0,32	0,71
Эфедрин	0,12	0,20	0,46

4. Вид и последовательность применения реактивов обнаружения опиатов. В качестве реактивов обнаружения с учетом их чув-сти и избирательности использовали: 1. йодплатинатный кислый реагент, 2. реактив Драгендорфа в модификации Мунье, 3. 10% FeCl₃, 4. Реактив Марки-Манделина - обработка пластинки парами формальдегида + опрыскивание в р-р конц. H₂SO₄ с ванадатом аммония (получение наиболее воспроизводимых результатов), 5. реакцию образования псевдоморфина (2,2'-диморфин) при взаимодействии с аммиачным р-ром ферри-ферроцианида калия; 6. Пробу с р-ром феррицианида калия и сульфата меди для выявления героина.

Кроме опиатов исследовали ряд в-в, встречающихся как добавки к "уличному" героину, а также влияние экстрактивных в-в из мочи и ее гидролизатов на результаты реакций.

В табл. 4 приведены результаты применения выбранных реакций обнаружения. Сравнение данных табл. 3 и 5 показывает, что использование наряду с хроматографическим разделением в системах 1, 4, 8 комплекса цветных реакций позволяет повысить избирательность идентификации опиатов методом ТСХ.

Таблица 4. Реакции обнаружения опиатов, некоторых наркотиков и лекарств и наблюдаемые окраски при ТСХ-анализе на пластинках сорбфил ПТСХ-ПА в системах растворителей 1 и 3.

Исследуемое вещество	Реактивы и результаты реакций (окраска пятен)
	реактив Драгендорфа	йод-платинатный реактив	1% CuS04 и K3Fe(CN)6, 1:1	реактив Марки-Манделина*	K3Fe(CN)6+K4Fe(CN)6+ УФ-свет, 254-366 нм**	10% FeCI3
Героин	От оранжевого до коричневого (0,2)	Темно-фиолетовое (0,2)	Розово-брусничное (0,2)	Темно-фиолетовое (0,2)	-	-
6-МАМ	Оранжево-коричневое (0,2)	Фиолетовое (0,2)	То же	Синее (0,3)	Свечение желто-сероватой окраски***	Голубое*4
Кодеин	То же	Сине-пурпурное (0,2)	То же	Темно-синее (0,3)	-	-
Морфин	То же	Сине-фиолетовое (0,2)	То же	Фиолетовое (0,25-0,3)	Голубая флюоресценция (0,2-1)	Синее (1-2,5)
Нарцеин	То же (0,3-0,4)	Пурпурное	Розово-сиреневатое	Коричневоезеленое*5	-	-
Наркотин (носкапин)	То же	То же	Розово-брусничное	Темно-фиолетовое	Слабая голубоватая флюоресценция*6	-
Папаверин	То же	То же	-	Пурпурно-фиолетовое	-	-
Промедол	То же	Темно-фиолетовое	Розово-брусничное	Малиновое	-	-
Трамадол	Коричневое	То же	Розово-брусничное	Коричневое  бирюзовое*7	-	-
Бензофенон диазепама	Светло-коричневое	Без изменения (исходно желтое)	Медленно розовеет	-	Яркая голубая флюоресценция	-
Диазепам	Коричневое	Светло-коричневое	-	-	-	-
Димедрол	То же	То же	Розово-брусничное	Лимонно-желтое	-	-
Кокаин	Темно-коричневое	Коричневое	-	-	-	-
Кофеин	Темно-фиолетовое	То же	-	-	-	-
Никотин	Коричневое	То же	Розовое	-	-	-
норникотин		Зеленое	-	-	Яркая флюоресценция	-
котинин		Зеленоватое	-	-	-	-
Эфедрин	Светло-коричневое	Коричневое (быстро исчезающее)	Розово-брусничное	-	-	=
Экстрактивные в-ва из мочи	Коричневое	Светло-коричневое	Розовое	Темно-коричнево-бурое	Голубая флюоресценция	Буро-коричневатое
Примечание. Прочерк - отсутствие окрашивания или флюоресценции: в скобках указаны пределы детектирования в-ва (в мкг в пробе). * - при проведении пробы с реактивом Марки в варианте обработки хроматограммы парами формальдегида пределы детектирования составили: для морфина - 0,5 мкг, для кодеина, героина и 6-МАМ - по 0,3 мкг; ** - проба - реакция образования псевдоморфина (2,2'-диморфин); *** - свечение пятен желтовато-сероватого цвета наблюдалось при концентрации 6-МАМ от 0,3-0,5 мкг; *4 - окраска пятен наблюдалась при кол-вах 6-МАМ не менее 3-5 мкг; *5 - характерное зеленое окрашивание наблюдалось сразу при промывании пластинки водой после проведения реакции Марки-Манделина; *6 - реакция воспроизводилась только при содержании носкапина не менее 100 мкг в пятне; *7 - бирюзовое окрашивание наблюдалось при промьшшии пластинки водой после проведения пробы с реактивом Марки.

Наиболее чув-ными реактивами детектирования морфина, кодеина, героина, 6-МАМ (см. табл. 4) являются йодплатинатный реагент и реактив Драгендорфа в модификации Мунье. Эти 2 реакции следует рассматривать (в отношении только ТСХ-анализа) как имеющие отрицательное суд.-хим. значение. Положительный результат этих проб и соответ. результаты определения обнаруженных соединений требуют подтверждения более избирательными реакциями: с реактивами Марки и Марки-Манделина, пробой с FeCl₃ и реакцией образования псевдоморфина.

Феррицианид-медный реактив также обладает высокой чув-стью обнаружения, и его м. рассматривать как универсальный для детектирования не только опиатов, но и ряда др. в-в (см. табл. 4). Его преимущества - доступность, дешевизна и возможность применения без снятия фона и на пластинках силуфол (в отличие от йодплатинатного и реактива Драгендорфа).. Наиболее целесообразным является его использование для детектирования на хроматограммах преимущественно метчиков-опиатов, т.к. он интенсивно проявляет на хроматограммах и соэкстрактивные в-ва из мочи и ее гидролизатов.

5. Количество вносимого на ТСХ-пластинку вещества (аликвота). При исследовании приграничных и граничных концентраций опиатов в моче для оптимального разделения на пластинки сорбфил и силуфол в пятно диаметром 0,3-0,4 см м.б. нанесена аликвота очищенного экстракта, эквивалентная не более 0,5 мл мочи, и аликвота неочищенного экстракта, эквивалентная ≤0,2 мл мочи.

Методика ТСХ-анализа опиатов. На стартовую линию ТСХ-пластинок ПТСХ-ПА (10х10 или 10х15 см, толщина слоя 110 мкм), предварительно активированных при 110С 1 ч, наносят в виде точек диаметром не более 0,3 мм аликвоты хроматографически очищенных экстрактов из гидролизованной и негидролизованной мочи, эквивалентные 0,5 и 0,1 мл мочи. Для перенесения остатков экстрактов на ТСХ-пластинки используют смесь абс. этанола с хлороформом (9:1) или метанол-хлороформ(9:1). На стартовую линию той же пластинки наносят метчики - р-ры морфина, кодеина, героина, 6-МАМ в этаноле с концентрацией 1 мг/мл по 5-10 мкл, пятно каждого аналита отдельно. Расстояние между пятнами аликвот экстрактов и метчиков составляет не менее 0,5 см. Хроматографируют в предварительно насыщенных в течение 40-50 мин соответ. растворителями хроматографических камерах с бумажными вкладышами. Смеси растворителей готовят ежедневно. Фронт растворителя 7,5-10 см.

Исследование методом ТСХ начинают хроматографированием в системах растворителей 1 или 8. Полученную хроматограмму высушивают при 40°С для удаления растворителя и аммиака и проводят реакции обнаружения. При положительном результате анализа в системе растворителей 1 (толуол-ацетон-этанол-NH₃•Н₂О, 45:45:7:3) или 8 (ацетонитрил-хлороформ-этилацетат-NH₃^.H₂O, 40:30:25:5) дальнейшее исследование экстрактов производят в системе 4 (этилацетат-метанол-NH₃•Н₂О, 85:10:5) или 3 (этилацетат-абс.этанол-NH₃, 90:30:10). Детектирование зон опиатов проводили реактивом Драгендорфа в модификации Мунье, йодплатинатным кислым реактивом, реактивом Марки и Фреде.

Результаты ТСХ-исследования отдельных опиатов и их смесей в ТСХ-системе № 4 - этилацетат – метанол-аммиак (17:2:1) приведены в таблице 3.

Таблица 3. Значения величин Rf опиатов в системе 4 - этилацетат-метанол-25% NH₃•Н₂О (17:2:1).

Соединение	Rf
Морфин	0.32-0.39
Героин	0,52 0,66
Кодеин	0.35-0.54
Дионин	0.41-0,46
Наркотин	-
Папаверин	0.79-0.83
Героин-6-МАМ	1,14
Героин-кодеин	2,00
6-МАМ-кодеин	1,50
Кодеин-морфин	1,69

Обнаружение опиатов на хроматограммах м. проводить при последовательном применении 2 разных реакций на одной и той же пластинке. При этом порядок проведении реакций обнаружения следующей: 1-ю хроматограмму опрыскивают йодплатинатным кислым реактивом; 2-ю - сначала FeCl, затем (не менее чем через 30 мин) - реактивом Драгендорфа по Мунье; на 3-й пластинке сначала проводят реакцию образования псевдоморфина, затем, через 40-50 мин, - пробу Марки-Манделина или Марки.

Пределы обнаружения опиатов в моче методом ТСХ по разработанной методике анализа при использовании всего комплекса хромогенных реакций (при аликвоте, эквивалентной 0,5 мл мочи) составляют: для морфина - 0,5-2,5 мкг в пробе (или 1-5 мкг/мл мочи); для кодеина и героина - 0,5-1 мкг в пробе (или 1-2 мкг/мл мочи). Пределы обнаружения опиатов в моче отдельными реагентами составляют для морфина, кодеина и героина при использовании реактива Драгендорфа и йодплатинатного - 0,5 мкг в пробе (или 1 мкг/мл мочи), при применении пробы Марки или Марки-Манделина - 1 мкг в пробе (или 2 мкг/мл мочи).

Заключение об обнаружении опиатов методом ТСХ дается на основании выявления на хроматограммах зон, совпадающих по значению Rf и характеру окрашивания с хромогенными реактивами с зонами стандартных р-ров метчиков морфина, кодеина, героина.

4. Иммунологические методы.

1. Радиорецепторный анализ опиатов. Является скрининговым методом, выявляет опиаты, при больших концентрациях – димедрол и галоперидол. Чув-сть 10^-10моль/л.

2. Метод ИФА. Особое приемущество – применение для трупной крови и мочи. Может быть использлван для качетсвенного, и для количественного анализа на опиаты. Метод ИФА на наркотики является предварительным и д. подтверждаться хроматографическими методами с колич.определением опиатов.

3. Метод сухой иммунохимии (тест-полоски). Является скрининговым методом анализа на опиаты. (порог 200 нг/мл).Тест-полоски для определения опиатов в моче применимы для жидкости из перикарда (больше положительных результатов). Принцип метода. Введенные морфин и его метаболиты конкурируют с морфином, иммобилизованным на пористой мембране иммунохроматографической пластинке. АГ реагируют со специф. моноклональным АТ к морфину, связанным с молекулами золота. Комплекс АГ-АТ реагирует конкурентно с иммобилизованным АТ, при этом полоска розового цвета в тестовой зоне не проявляется – 1 полоска – уровень морфина в моче 300 нг/мл и более.

5. УФ- и ИК-спектроскопия опиатов. Характеристики УФ- и ИК-спектров отдельных опиатов приведены ы таблице 6.

Ттаблица 6. УФ- и ИК-спектры опиатов.

В-во		Максимум УФ-спектра, нм	Пики ИК-спектра (см-1)	Масс спектрометрия m/z
Морфин	Основание	287 (этанол), 296 (0,1н NaOH), 284 (0,1н H2SO4)	805, 1243, 1448 и 945 (KBr)
	Гидрохлорид, сульфат	285 (вода)
Кодеин		285 (вода)	1052, 1500, 1268, 1111, 793, 934	299, 42, 162, 124, 59, 300, 69
Апоморфин

6. Фармакологическое испытание на морфин д. производиться фармакологом.

При применении морфина и кодеина в терапевт.дозах их определяют в моче иммунными методами, при соответ. концентрациях - методами ТСХ, ГХ-МС и др.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

1. Спектрофотометрические методы.

1. ФЭК-метод определения морфина основан на определении комплекса морфина с кремнемолибденовой кислотой, обладающего синей окраской (по В.Ф.Крамаренко). Чув-сть 0.2-4 мг морфина в пробе.

2. Экстракционно-фотоколориметрический метод определение кодеина основан на реакции с тропсолином 00, при которой образуется ионный ассоциат, экстрагирующийся хлороформом. Чув-сть - 0.2-2 мкг кодеина.

2. Хроматографические методы.

1. Метод капиллярной ГХ. Скрининг-анализ образцов мочи на содержание в них опиатных Ал проводится методом радиорецепторного анализа (РРА), затем наличие опиатов подтверждается методом капиллярной ГХ. Этими 2 методами анализируют все образцы мочи, объем которых является недостаточным для анализа ТСХ ("малые объемы"). Комплексное примнение этих методов дает высокую чув-сть, высокую достоверность результатов анализа и высокуб воспроизводимость результатов (92-94%).

3. Методы ГЖХ и ВЭЖХ. Разработаны методики определения Ал опия и их производных (морфин, кодеин, 6-МАМ и др.) в крови, моче и волосах человека, методики одновременного определения смеси нативных опиатов, их метаболитов и смесей пиатов с другими веществами и лекарствами (биогенные амины, дилаудид, налтрепсон, налоксан, гидроморфон, метахлопрамид) в крови, в моче, спинномозговой жидкости и обособленных областях мозга в эксперименте у крыс. В качестве внутренних стандартов использованы дигидроморфинон, диазепам, налорфин, N-этилморфин, кофеин и 3,4-дигидроксибензиламин. Анализ проводился за 10-15 мин.

Для повышения чув-сти детектирования предложено получать дансильные производные Ал в обычном или автоматическом режимах. Показана возможность использования прямого ввода пробы или введения в колонку парофазной системы надосадочной жидкости.

В анализе Ал опия и их производных в различных объектах в основном использовали обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ, реже - нормально-фазовый режим. Метод ВЭЖХ с масс-спектрометрией хим.ионизации при атмосферном давлении.

Ввиду малых концентраций в-в в биообъектах использовалось более чувствительное детектирование: электрохимическое, флюориметрическое и хемолюминесцентное с пределами обнаружения 200пг-2нг, 10пг-1нг, 50пг - 5 нг соотв-но. Например, морфин и 6-МАМ образуют флюоресцирующие комплексы с ферри-ферроцианидом, которые детектируются методом ВЭЖХ.

Метод ВЭЖХ еще не нашел должного применения в анализе Ал опия, выделенных из трупного материала, а также в случаях их комбинированного применения с др. в-вами. Реализация приведенной перспективы значительно повысит эффективность хим.-токсикол. и суд.-хим. экспертиз.

3. Иммунологические методы.

Поляризационный иммунофлюоресцентный анализ: набор ПФИА-1 на опиаты общие (порог 200 нг/мл) и набор ПФИА-2 на морфин (порог 150 нг/мл).