- •Содержание
- •Глава 1. Обзор литературы
- •1.1.Кальпаин / кальпастатиновая протеолитическая система.
- •1.2.Биохимические механизмы нейродегенеративных заболеваний
- •Глава 2.Материалы и методы исследования
- •2.1 Реагенты и приборы
- •2.2 Моделирование нейродегенерации у лабораторных животных
- •2.3 Анализ биохимических показателей
- •2.3.1 Экстракция белков из тканей
- •2.3.2 Определение активности кальпаинов
- •2.3.3 Зимография с козеином
- •2.3.4 Электрофорез белков в полиакриламидном геле
- •2.3.5 Вестерн-блот анализ
- •2.3.6 Другие методы
- •Глава 3.Результаты исследования и их обсуждение
- •3.1. Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых индуцированной бета-амилоидом нейродегенерации на фоне эстрогенной терапии
- •3.2 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых глутамат-индуцированной нейродегенерации на фоне терапии потенциальными нейропротекторами
- •Заключение
- •Список литературы
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования
«Петрозаводский Государственный Университет»
(ПетрГУ)
Эколого-биологический факультет
Кафедра молекулярной биологии, биологической и органической химии
Прокопенко
Христина Николаевна
Специальность
«Биология»
АКТИВНОСТЬ КАЛЬЦИЙЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНАЗ В МОЗГЕ КРЫС
С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ НЕЙРОПАТОЛОГИЕЙ
Дипломная работа
Научный руководитель:
кандидат биологических наук,
ведущий научный сотрудник ИБ КарНЦ РАН
Лысенко Людмила Александровна
Петрозаводск, 2015.
Содержание
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Кальпаин/кальпастатиновая протеoлитическая система
1.2 Биохимические механизмы развития нейродегенеративных заболеваний
ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Реагенты и приборы
2.2 Моделирование нейродегенерации у лабораторных животных
2.3 Анализ биохимических показателей
2.3.1 Экстракция белков из тканей
2.3.2 Определение активности кальпаинов
2.3.3 Зимография с казеином
2.3.4 Электрофорез белков полиакриламидном геле
2.3.5 Вестерн-блот анализ
2.3.6 Другие методы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых индуцированной бета-амилоидом нейродегенирации на фоне эстрогенной терапии
3.2 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых глутамат-индуцированной нейродегенирации на фоне терапии потенциальными нейропротекторами
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Нейродегенеративные заболевания ‒ болезни Альцгеймера, Паркинсона и другие – представляют в странах с высокой продолжительностью жизни населения огромную медицинскую, социальную, финансовую и научную проблему. Распространенность этих заболеваний растёт по мере старения населения, и большинство развитых стран уже сейчас оказывают специальную поддержку исследованиям в области изучения нейродегенеративных заболеваний.
К настоящему времени участие внутриклеточных протеиназ в нейродегенеративных процессах не вызывает сомнений. С одной стороны, недостаточная интенсивность протеиназозависимых процессов при нейродегенеративных заболеваниях способствует накоплению большого количества патологических белков, например, бета-амилоида и тау-протеина при болезни Альцгеймера, альфа-синуклеина при болезни Паркинсона и других. С другой стороны, протеиназы регулируют основные пути гибели клеток при нейродегенерации – апоптоз, некроз и аутофагию. Таким образом, для нервной ткани жизненно важно поддержание тонкого баланса активности протеиназ, при этом может быть необходимым как повышение их активности для разрушения патогенных белков, так и снижение – для предотвращения массовой гибели нейронов. Са2+-зависимые протеиназы, или кальпаины, относящиеся к семейству С2 цистеинового типа, представлены в тканях ЦНС пятью ферментами – основными μ- и m-кальпаинами (КФ 3.4.22.52 и 3.4.22.53, соответственно) и минорными кальпаинами 3, 5 и 10. Участие Са2+-зависимых протеаз в нейродегенеративных процессах – общебиологическое явление, обнаруживаемое у широкого круга организмов – от нематоды С. elegans до приматов.
В силу особенностей биологии (неспособность к митозу) нейроны особенно чувствительны к накоплению недеградированных продуктов белкового обмена, в норме эффективно разрушаемых внутриклеточными протеиназами. Известно, что в нормальных условиях более 25% синтезированных de novo клеточных белков содержат ошибки и подвергаются быстрому разрушению. Ослабление протеиназоассоциированной функции контроля качества клеточных белков (в силу нарушения синтеза и/или регуляции протеиназ из-за сенильных изменений или при действии неблагоприятных экзогенных или эндогенных факторов) приводит к накоплению клеточных белков с ошибками биосинтеза и с нарушенной конформацией. Дефектные белки нефункциональны, участвуют в аберрантных взаимодействиях, образуют нерастворимые белковые агрегаты и приобретают свойства цитотоксичности. В связи с этим, проект направлен на изучение роли внутриклеточных протеиназ в механизмах возрастной и патологической нейродегенерации.
Целью экспериментальной и теоретической работы было изучение роли внутриклеточных кальцийзависимых протеиназ (кальпаинов) в развитии индуцированных нейродегенеративных нарушений и механизмов торможения кальпаинозависимых этапов нейродегенерации путём введения нейропротекторов. Объект исследования - лабораторные крысы- биомодели нейродегенеративных патологий человека. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1) анализ литературных источников по проблеме разнообразия молекулярных форм кальпаинов в тканях млекопитающих, их эндогенных регуляторов и роли кальпаиновой системы в развитии нейродегенеративных процессов;
2) освоение методических приёмов выделения кальцийзависимых протеиназ из тканей животных, разделения их молекулярных форм, определения протеолитической активности, количественной оценки уровня ингибитора кальпастатина;
3) проведение экспериментов с лабораторными животными: индуцирование нейродегенерации путём введения экзогенных веществ, её коррекция потенциальными нейропротекторами, проведение поведенческих тестов, взятие биологического материала (органов крыс) для биохимического анализа;
4) биохимический анализ протеолитической активности разных молекулярных форм кальпаинов и количественная оценка их ингибитора - кальпастатина в нервной ткани крыс разных экспериментальных групп;
5) анализ результатов об участии кальпаинов и их регуляторов в развитии индуцированной нейропатологии и возможности купирования кальпаинозависимых нарушений потенциальными нейропротекторами.