2.3 Анализ биохимических показателей

2.3.1 Экстракция белков из тканей

У лабораторных животных (крыс) для последующего биохимического анализа были взяты образцы нервной ткани – гиппокампа и коры больших полушарий. Учитывая дисперсность пула кальпаинов в клетке, связанную со спецификой их регуляции, определяли показатели как в цитозольной фракции клеток, так и во фракции мембрано-связанных белков, полученных по методу (Enns, Belcastro, 2006). Цитоплазматическую фракцию получали из ткани, гомогенизированной в 20 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7.5) с добавлением 80 мМ КСl, 5 мМ Na-соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 20 мМ дитиотреитола (DTT) (соотношение 1:10, вес/объем) с последующим центрифугированием (20 000 g, 20 мин). Фракцию мембраносвязанных белков – повторным центрифугированием (20 000 g, 20 мин) получившегося осадка, предварительно ресуспендированного в равном объеме того же буфера с добавлением 0.33% тритона X-100. Буфер для гомогенизации включал смесь ингибиторов протеиназ: лейпептина (0.5 мкг/мл), пепстатина (1 мкг/мл), апротинина (1 мкг/мл) и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF).

Буфер для гомогенизации, (объём 500 мл)

• 20 мМ Трис, навеска 1,2114 г

• 80 мМ хлорида натрия, навеска 2,98 г

• 5 мМ ЭДТА, навеска равна 0,9306 г

• 20 мМ ДТТ, навеска равна 1,54 г

• растворить в дистиллированной воде, довести рН до 7,5 5 конц. HCl

• довести водой до 500 мл в колбе

Буфер для гомогенизации с тритоном Х-100 (объём 100 мл)

• 0,33 % тритон Х-100, навеска 0,33 г.

• довести до 100 мл буфером для гомогенизации.

Ингибитор PMSF (объем 10 мл)

• 100 мМ PMSF, навеска 174 мг

• растворить в 10 мл изопропанола

• разлить по аликвотам 0,5 мл, заморозить при -20 ^оС

2.3.2 Определение активности кальпаинов

В полученных фракциях цитозольных и мембраносвязанных белков оценивали активность кальпаинов – Са²⁺-зависимую казеинолитическую активность, чувствительную к ингибиторам цистеиновых протеиназ (Enns, Belcastro, 2006). Реакционная смесь, объемом 500 мкл, включала 0.5 мг казеина, денатурированного щелочью, 20 мМ DTT, 200 мкл ферментной фракции и 2.5 мМ СаСl₂ или EDTA (для оценки Са²⁺-зависимой и Са²⁺-независимой активности, соответственно) в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7.5). После 30-минутной инкубации (28°С) в аликвотах 100 мкл спектрофотометрически определяли содержание остаточного белка по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Единицу активности кальпаинов (ед.акт.) определяли как количество фермента, вызывающее увеличение оптического поглощения на 0.1 OE при 595 нм за 1 ч реакции в указанных условиях. Удельную активность определяли в расчете на 1 мг белка соответствующей фракции.

1. Буфер для реакции (объём 500 мл)

• 20 мМ ДТТ, навеска 1.55 г

• 70 мМ Трис, навеска 4,235 г

• прилить дистиллированной воды, довести рН до 7,5 конц. HCl

• довести дистиллированной водой до 500 мл

2. На буфере для реакции – 0,1 М раствор хлорида кальция (объём 100 мл)

• хлорид кальция, навеска 1,47 г

• довести до 100 мл буфером для реакции

3. На буфере для реакции 0,1 М раствор ЭДТА (объём 100 мл)

• ЭДТА, навеска 3,72 г

• довести до 100 мл буфером для реакции