Руководство к практическим по биохимии

6.Выясните, на каких свойствах белков основаны методы их разделе­ ния на фракции путем высаливания, электрофореза, хроматографии.

7.Выясните, какие существуют методы хроматографического ана­ лиза, на чем они основаны, для чего используются.

8.Приведите доказательства обратимости осаждения белка солями щелочных и щелочно-земельных металлов, приведите примеры использования этого метода.

9.Выясните, что обозначает понятие «изоэлектрическая точка белка», как влияет химический состав белка на изоэлектрическую точку.

10.Зарисуйте схему «Классификация методов; разделения белков».

Рис. 1. Классификация методов разделения белков

Ориентировочная карта действия

2.Укажите основные факторы стабилизации белков в растворах.

3.Укажите, какими методами можно выделить белки в осадок без потери ими нативных свойств.

4.Поясните, почему при высаливании глобулины выпадают в оса­ док при меньшей концентрации соли, чем альбумины.

5.Перечислите факторы, определяющие заряд белка.

6.Дайте определение понятию изоэлектрическая точка белка.

7.Поясните, почему изоэлектрическая точка белка казеина нахо­ дится в кислой среде.

8.Поясните принцип гель-фильтрации, укажите, для чего исполь­

зуется данный метод.

9Перечислите способы очистки белков от низкомолекулярных со­ единений.

10. Поясните принцип электрофореза. Назовите фракции белков сыворотки крови при электрофорезе на бумаге.

Тестовые задания

1.Определите суммарный заряд (в условных единицах) данного пепти­ да при растворении его в воде при нейтральной реакции среды:

3.Укажите характер заряда белка при рН 7,0, если его изоэлектри­ ческая точка равна 9,0.

4.Присоединение к пептиду ала-вал-гли-тре одного из трипептидов

5.Определите, в какой среде находится изоэлектрическая точка белков гистонов, богатых аминокислотами лизин и аргинин.

6.Расположите в логической последовательности приемы, позво­ ляющие выделить из ткани индивидуальный белок

7.Укажите, в какой последовательности будут выходить белки при гель-фильтрации их смеси через колонку, заполненную сефадексом:

1.Трансферрин {молекулярная масса 88000);

2.Интерферон (молекулярная масса 25000);

3.Иммуноглобулин (молекулярная масса 95000);

4.Инсулин (молекулярная масса 6000);

5.Яичный альбумин (молекулярная масса 45000).

8.Укажите причину створаживания прокисшего молока

1.Кислотный гидролиз казеина;

2.Денатурация казеина в кислой среде;

3.Денатурация альбумина в кислой среде;

4.Достижение изоэлектрической точки казеина и его агрегация;

5.Образование комплекса белка с органическими кислотами.

9.Определите направление движения в электрическом поле (к ано­ ду или к катоду) белка, изоэлектрическая точка которого рН 9,0 в нейтральном буфере (рН 7,0).

10.Для разделения смеси белка и сульфата аммония можно ис­ пользовать

Занятие 4. Структурная организация белков

Мотивация: Знание структурной организации белков необходимо для понимания свойств белковых молекул, причин возникновения заболеваний, связанных с нарушением структуры и свойств белков.

Цель занятия: Изучить структурную организацию белковых моле­ кул, химические связи, формирующие ее; изменения свойств белков при денатурации; причины протеинопатий; классификацию белков.

Студент должен:

Вопросы, изученные ранее и необходимые для данного занятия:

Основная литература:

1.Березов Т. Т., Коровкин Б, Ф. Биологическая химия. - 1990. - С. 40-76; 1998.- С. 47-77.

2.Николаев А. Я. Биологическая химия. - 1998.- С. 18-36.

3.Биохимия / Под ред. Е. С. Северина. - 2003 - С. 16-38, 56-60.

4.Алейникова Т. Л. и соавт. Руководство к практическим занятиям по биологической химии - 1988. - С. 8-9, 30-32; 2000.- С, 19-22.

Дополнительная литература:

1.Ленинджер А. Основы биохимии. - 1985. - Т. 1. - С. 141-225.

2.Рис Э., Стерберг И. От клеток к атомам. - 1983. - С. 31-41.

3.Марри Р. и соавт. Биохимия человека. - 1993. - С . 42-51.

Вопросы и задания для самоподготовки

1.Выясните зависимость физико-химических свойств белков от их первичной структуры.

2.Дайте определение понятию «видовая специфичность белка». На примере инсулина различных видов ЖИВОТНЫХ покажите ви­ довую специфичность первичной структуры.

3.Выясните, что такое первичная структура белка, какие связи уча­ ствуют в ее образовании. Охарактеризуйте эти связи.

4.Выясните, как образуется вторичная структура белка, какие свя­ зи ее стабилизируют, какие типы ее выделяют.

5.Охарактеризуйте третичную структуру белка, поясните механизм образования связей, стабилизирующих ее. Используя учебник биохимии, представьте на рисунках примеры нековалентных связей, стабилизирующих нативную конформацию белка.

6.Выясните, что такое четвертичная структура белка, какие связи участвуют в ее образовании. Укажите роль шаперонов в форми­ ровании конформации белков.

7.На примере гемоглобина выясните сущность кооперативных из­ менений конформации протомеров и зависимость биологической активности от четвертичной структуры.

8.Выясните механизм денатурации белков, определите, какие свя­ зи разрушаются при денатурации и как это сказывается на бел­ ковых структурах.

9.Объясните процесс гидролиза белка, перечислите факторы ко­ торыми он вызывается. Назовите вид гидролиза, характерный для живых организмов.

10.Дайте классификацию белков, отметьте отличие простых белков от сложных, назовите простатические группы сложных белков.

Ориентировочная карта действия

Задания для контроля усвоения темы

1.Укажите, в образовании каких химических связей могут прини­ мать участие радикалы аминокислот следующего фрагмента пептидной цепи: -фен-арг-асп-ала-лей-.

2.Назовите связи, стабилизирующие третичную структуру белка.

3.Поясните различие водородных связей, стабилизирующих вто­ ричную и третичную структуру.

4.Поясните влияние четвертичной структуры на свойства белка.

5.Поясните, как осуществляется генетический контроль белковой структуры.

6.Дайте определение понятию «олигомерный белок».

7.Дайте определение понятию «протеинопатия». Приведите при­ меры протеинопатий.

8.Поясните, почему соли тяжелых металлов вызывают денатура­ цию белка. Назовите связи, разрушающиеся при этом.

9.Назовите условия обратимой денатурации белков.

10.Назовите соединение, нарушающее взаимодействие гемоглоби­ на с его естественным лигандом кислородом.

1.Пептидных;

2.Водородных между полярными радикалами,

3.Водородных между элементами пептидных группировок;

4.Гидрофобного взаимодействия;

5.Ионных.

2. Радикалы пептида -вал-фен-три-лей- могут участвовать в обра­

3.Гидрофобных,

3.Радикалы пептида -лиз-асп-вал-фен-глу- могут участвовать в об­

3.Гидрофобных;

4.Вторичная структура белка стабилизируется

1.Водородными связями между остатками амино- и карбок­ сильных групп пептидных связей,

2.Водородными связями между радикалами аминокислот;

3.Гидрофобными связями;

4.Ионными связями;

5.Пептидными связями,

5.Разрушение первичной структуры белка называется

3.Высаливание,

6.При денатурации белка разрушается структура

3.Третичная;

7.Структурно и функционально обособленную область белка называют

8.Для определения N-концевой аминокислоты используется реак­ ция

1.С фтординитробензолом;

2.Гидролиза карбоксипептидазой;

3.Гидролиза трипсином;

4.Гидролиза химотрипсином,

5.Гидролиза пепсином

9.Замена глутаминовой кислоты в шестом положении В-цепи гемо­ глобина на валин приводит к возникновению заболевания

10.При гидролизе белка получена смесь аминокислот и фосфорная кислота. Назовите класс гидролизованного белка.

РАЗДЕЛ III: ФЕРМЕНТЫ

Занятие 5. Химическая природа ферментов, их специфичность и обнаружение

Мотивация: Знание химической природы ферментов, механизма их действия необходимо для понимания природы биокатализа и даль­ нейшего изучения свойств ферментов.

Цель занятия: Закрепить представления о химической природе ферментов, особенностях ферментативного катализа, специфично­ сти ферментов, принципе обнаружения ферментов.

Студент должен:

Вопросы, изученные ранее и необходимые для данного занятия:

Основная литература:

1.Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. - 1990. - С. 92-104, 112-115, 124-125; 1998. - С . 114-134.

2.Николаев А. Я. Биологическая химия. -199(3. - С. 53-78, В1-83, 89-90.

3.Биохимия / Под ред. Е. С. Северина. - 2003. - С. 76-80, 83-88, 9295,99, 120.

4.Алейникова Т. Л. и соавт. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. - 1988. - С. 74-76; 2000.-- С. 31-32.

Дополнительная литература:

1.Ленинджер А. Основы биохимии. - 1985. -Т. 1. - С. 226-244.

2.Марри Р. и соавт. Биохимия человека. - 1993. - Т . 1 . - С . 63-81.

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Рассмотрите основные различия в действии неорганических ка­ тализаторов и ферментов.

2.Предложите методы, с помощью которых можно доказать бел­ ковую природу ферментов.

3.Объясните, почему присутствие фермента снижает энергетиче­ ский барьер реакции.

4.Объясните роль активного центра в реакциях ферментативного катализа.

5.Рассмотрите химическую природу ферментов, поясните, какие компоненты могут входить в состав сложных ферментов.

6.Нарисуйте схему образования фермент-субстратного комплекса (учебник Т. Т. Березова, Б. Ф, Коровкина, 1990, с.105; 1998, с.131).

7.Начертите и дополните табл. 2, в которой укажите, какие ви­ тамины входят в состав перечисленных коферментов и в каких реакциях они участвуют.

8.Выясните, что такое аллостерическии центр, объясните механизм изменения ферментативной активности при воздействии аллостерических эффекторов.

9.Рассмотрите примеры различной специфичности ферментов (абсолютная, относительная, стереохимическэя).

10.Выясните принцип обнаружения ферментов в биологических объектах, единицы ферментативной активности.

Ориентировочная карта действия

вследствие сдвига реакции в щелоч­

ную сторону.

6. Тирозиназа - фермент, катализирую­

щий первую стадию окисления тирозина и других производных фенола в окра­ шенные меланиноподобные вещества.

К 2 мл 1% раствора тирозина добавить 0,5 мл водной вытяжки картофеля, по­ ставить в термостат (температура 37°С).

В, Каталаза фермент, катализирующий реакцию разложения пероксида водоро­ да на молекулярный кислород и воду.

В пробирку налить 10-15 капель 1% раствора пероксида водорода, доба­ вить 1 каплю крови. Происходит бур­ ное выделение пузырьков кислорода,

жид кость вспенивается.

Г. Пероксидаза - Фермент, катализи­ рующий реакцию окисления фенолов, полифенолов, ароматических аминов в присутствии пероксида водорода.

В две пробирки налить по 5 капель гвая­ ковой смолы и по 5 капель 2% раствора

пероксида водорода. В первую пробирку добавить 5 капель вытяжки из хрена во вторую (контроль) - 5 капель воды. На­

блюдать изменение окраски (синий цвет). Д. Амилаза - фермент, катализирую­ щий гидролитическое расщепление крахмала с образованием мальтозы (промежуточными продуктами могут быть различные декстрины).

В пробирку набрать 1 мл разведенной слюны (1:10), прилить 1 мл 1% рас­ твора крахмала. Инкубировать в тер­ мостате 15 мин при 37°С. Пробу раз­ лить поровну в 2 пробирки. В первой пробирке провес™ пробу Троммера (на наличие продукта реакции - маль­ тозы или глюкозы); во второй провести цветную реакцию с 1% раствором J2 в KJ (при наличии субстрата - крахмала - наблюдается синее окрашивание).

Задания для контроля усвоения темы

1.Назовите, как изменяется скорость реакции, константа равнове­ сия в присутствии неорганических катализаторов и ферментов.

2.Перечислите основные свойства ферментов, обусловленные их белковой природой.

3.Объясните, почему в присутствии фермента скорость химической реакции увеличивается.

4.Реакция разложения пероксида водорода требует энергии актива­ ции 75,4 кДж/моль, в присутствии платины энергия активации сни­ жается до 48,9 кДж/моль, в присутствии фермента катапазы - до 5,4 кДж/моль. Укажите, в каком случае скорость реакции будет выше.

5.Назовите участки, которые можно выделить в активном центре фермента.

6.Дайте определения терминам «кофермент», «простетическая группа», «апофермент», «холофермент».

7.Поясните, каким типом специфичности обладает фермент липа­ за, гидролизующий триглицериды, обоснуйте ответ.

8. Укажите, в каких единицах выражается активность ферментов.

9Перечислите коферменты, участвующие в транспорте протонов и электронов.

2 Комбинация аминокислот в ферменте, обеспечивающая взаимо­ действие с субстратом и катализ называется

3.Небелковая часть фермента, прочно связанная с апоферментом, называется

4.В реакциях карбоксилирования участвует кофермент

3.Биотин;

5.В переносе водорода участвуют коферменты

6.Участок молекулы фермента, при связывании с которым опреде­ ленных веществ изменяется активность фермента, называется

3.Каталитический центр,

7.Фермент сахараза, гидролизующий связь между глюкозой и га­ лактозой в олигосахаридах лактоза и рафиноза, обладает

специфичностью.

8.Фермент ЛДГ представлен сочетанием субъединиц

1.НННН, 2. нннм, з. НHMM; 4. нммм; 5. ММММ

9.Количество фермента, способное превратить 1 моль субстрата в продукт в 1 секунду, называется

3.Число оборотов;

10.Удельную активность фермента принято выражать

Занятие 6. Основные свойства ферментов

Мотивация: Знание основных свойств ферментов необходимо для понимания условий функционирования ферментов в организме, из­ менения их активности под влиянием различных: факторов.

Цель занятия: Изучить основные свойства ферментов, кинетику ферментативных реакций.

Студент должен:

Вопросы, изученные ранее и необходимые для данного занятия:

Основная литература:

1.Березоа Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. - 1990. - С. 112-126; 1998.- С. 134-158.

2.Николаев А. Я. Биологическая химия. -- 1998. - С. 73-84.

3.Биохимия / Под ред. Е. С. Северина. -2003. - С . 97-108, 112-118.

4.Алейникова Т. Л. и соавт Руководство к практическим занятиям по биологической химии. - 1988. - С. 60-61, 63-65, 79-80.

Задания для контроля усвоения темы

1.Объясните, почему при температуре выше 50° скорость фермен­ тативной реакции снижается.

2.Объясните, почему при изменении рН меняется образование фермент-субстратного комплекса.

3.Дайте определение понятию «константаМихаэлиса».

4.Приведите примеры кофакторов ферментов, объясните меха­ низм их влияния.

5.Приведите примеры ферментов, синтезируемых в виде профер­ ментов. Поясните механизм их превращения в активную форму.

6.Поясните, почему присутствие цистеина может изменить актив­ ность некоторых ферментов.

7.Укажите, по какому типу цианиды блокируют фермент цитохромоксидазу.

8.Назовите основные свойства конкурентных ингибиторов.

9.Укажите, для каких реакций характерно аллостерическое ингибирование.

10.Поясните, почему сульфаниламидные препараты подавляют рост бактериальных клеток.

Тестовые задания

1. Причиной быстрого снижения активности фермента при темпера­ туре 50-60° является

1.Гидролиз;

2.Денатурация;

3.Образование недиссоциирующего фермент-субстратного

комплекса;

4.Ингибирование фермента избытком субстрата;

5.Образование ингибиторов-

2При увеличении рН желудочного сока до 5 активность пепсина .....

3.Величина константы Михаэлиса характеризует

1.Максимальную скорость реакции;

2.Минимальную скорость реакции;

3.Зависимость от рН;

4.Сродство фермента и субстрата;

5.Скорость диссоциации фермент-субстратного комплекса.

4.Сродство фермента гексокиназы, катализирующего реакцию фосфорилирования гексоз, выше к субстрату

1.Сорбитол (Км=2,0х10-6 моль/л),

2.Фруктоза (Км=1,5х10-6 моль/.п);

3.Галактоза (Км-1,0х10-6 моль/л);

4.Манноза (Км=0,6х10-6 моль/л);

5.Глюкоза (Км=:0,15х10-6 моль/л).

5.Скорость реакции пропорциональна количеству фермента в ус­

6 Активирование пепсиногена под действием соляной кислоты происходит за счет

1.Гидролитического отщепления пептида;

2.Образования дисульфидных мостиков;

3.Присоединения ионов хлора,

4.Присоединения простатической группы;

5.Фосфорилирования

7В инкубационную смесь содержащую фосфатный буфер, янтар­ ную кислоту, ФАД и сукцинатдегидрогеназу, добавлена малоно­ вая кислота. Скорость реакции при этом

8 При отравлении синильной кислотой (цианидами) тормозится ак­

3.Трипсина;

9.В смесь, содержащую субстрат, фермент и ингибитор внесли до­ полнительное количество субстрата. Скорость реакции при этом увеличилась. Определите тип ингибирования.

10. Большинство биохимических процессов в организме протекает в несколько стадий, каждая из которых катализируется определен­ ным ферментом:

Определите, какой фермент с наибольшей вероятностью будет тормозиться продуктом реакции по аллостерическому ТИПУ.

Занятие 7. Коллоквиум «Строение и свойства ферментов»

Мотивация: Знание строения и свойств ферментов способствует пониманию механизма их действия, пониманию значения определе­ ния активности ферментов для диагностики различных заболеваний и применению ферментных препаратов в медицине Цель занятия: Изучить методы разделения и очистки ферментов.

Классификацию ферментов. Различия ферментного состава органов и тканей, органоспецифичные ферменты. Значение определения ак­ тивности ферментов для диагностики заболеваний Наследственные энзимопатий. Вопросы энзимотерапии: применение ферментов, их активаторов и ингибиторов. Иммобилизованные ферменты.

Студент должен:

Вопросы, изученные ранее и необходимые для данного занятая:

Основная литература:

1.Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. - 1990. - С. 92-132; 1998.- С. 153-168.

2.Николаев А. Я. Биологическая химия. - 1998.- С. 83-92.

3.Биохимия / Под ред. Е. С. Северина. - 2003. - С. 80-83, 119-123.

Дополнительная литература:

1.Ленинджер А. Основы биохимии. - 1985. - Т. 1. - С. 137-160,226-269.

2.Марри Р. и соавт. Биохимия человека. -1993.-Т. 1.-С. 98-116.