Терминация репликации

Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепей вдоль концевой матрицы неизбежно приводит к совмещению З’-гидрокси и 5’-фосфорильного концов одной цепи либо в точке начала репликации, либо при двунаправленной репликации - в середине кольца. Кольца в этих местах встречи соединяются ДНК-лигазой, при этом обычно оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем должно произойти их разъединение на отдельные кольцевые молекулы ДНК. Это происходит с помощью топоизомеразы второго типа. Последовательности, которые обеспечивают терминацию у Е. coli называются ter-сайтами. Они содержат короткую (около 23 пн) последовательность. В участке терминации находится несколько ter-сайтов. Они располагаются примерно на 100 тпн дальше точки, в которой встречаются вилки репликации.

Репликация эукариот

1. Репликация ДНК у эукариот происходит на определенной стадии клеточного цикла, а именно в синтетической (S) фазе, и примерно в 10 раз медленнее. Время репликации ДНК у млекопитающих составляет 6-8 часов, а у бактерий около получаса.

2. Репликация ДНК эукариотической хромосомы осуществляется посредством разделений ее на множество отдельных репликонов и репликативных вилок. Остановка продвижения вилки происходит только при столкновении с другой вилкой, движущейся во встречном направлении.

Полагают, что у эукариотических организмов гомологами ориджинов репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, или ARS (autonomously replicating sequences), открытые в 1980 году и расположенные на расстоянии от 30 до 300 тпн друг от друга. Общая длина ARS- элементов составляет 100-200 пн. С этими последовательностями постоянно связаны белки комплекса ORC (origin recognition complex). При начале репликации к ORC подходят регуляторные белки инициирующие процесс.

3. У эукариот иной набор ферментов репликации. Механизмы репликации ДНК прокариот и эукариот существенно различаются в том отношении, что во втором случае синтез ведущей и отстающей цепей осуществляют разные ДНК-полимеразы (α и δ соответственно), тогда как у Е. coli обе цепи ДНК синтезируется ДНК-полимеразой III. ДНК-полимераза α проводит инициацию синтеза ведущей цепи в точках начала репликации, а ДНК-полимераза δ осуществляет циклические реинициации синтеза фрагментов Оказаки, длина которых для эукариот составляет 100-200 пн. Созревание фрагментов Оказаки у эукариот требует удаления РНК-затравок с помощью 5’3’-экзонуклеазы и РНКазы, а также ковалентного соединения фрагментов друг с другом под дейртвием ДНК-лигазы I.

4. Проблема «досинтеза» концов линейной ДНК. Теломеразы.

У эукариот геном представлен линейными молекулами ДНК в составе одной или нескольких хромосом. Размышления о механизмах репликации линейных молекул ДНК породили гак называемую проблему отстающей цепи ДНК. Проблема заключается в том, что синтез отстающей цепи ДНК, как уже было показано выше, происходит в виде коротких фрагментов Оказаки, для инициации синтеза которых требуются РНК-затравки. После удаления затравки на конце, по крайней мере, одной из вновь синтезированных цепей образуется одноцепочечная брешь, которая не может быть заполнена ДНК-полимеразой, поскольку она не функционирует в отсутствие праймера. Вследствие этого в каждом раунде репликации должно было бы происходить укорачивание хромосом с обоих концов, что приводило бы к потере генетической информации, закодированной в концевых фрагментах ДНК.

Исследование механизмов репликации концевых участков эукариотических хромосом - теломеров показало, что синтез теломерных последовательностей ДНК осуществляется специальными ферментами - теломеразами, для которых нет аналогов среди других известных нуклеотидилтрансфераз (рис). Особенностью этих ферментов является присутствие у них в качестве составной части короткого фрагмента РНК - компонента, необходимого для их функционирования и служащего матрицей при синтезе теломерных последовательностей хромосом. Комплементарное взаимодействие РНК теломеразы с З’-концевым выступающим одноцепочечным сегментом ДНК хромосомы инициирует синтез теломерных последовательностей. При этом 3’-концевой фрагмент ДНК служит затравкой для удлинения этой ДНК на РНК-матрице. После удлинения выступающей цепи ДНК до конца матрицы происходит транслокация фермента на один теломерный повтор вперед относительно матрицы с освобождением последовательности матричных нуклеотидов, после чего он готов для вступления в следующий цикл элонгации только что добавленной З’-концевой последовательности хромосомы. После завершения удлинения одноцепочечной З’-концевой теломерной последовательности вторая цепь ДНК достраивается обычным способом. Таким образом, происходит решение «проблемы отстающей цепи ДНК» при репликации ДНК у эукариот.

5. Нуклеосомная укладка ДНК эукариот. Еще одной особенностью репликации эукариотической ДНК является участие в этом процессе гистонов. Считается, что гистоны не покидают ДНК. Нуклеосомы временно раскрываются с образованием двух полунуклеосом, что дает возможность ДНК-полимеразе копировать развернувшуюся молекулу. Вновь синтезированная ДНК, наследует старые гистоны и получает такое же количество новых.

6. Метилирование. ДНК эукариот после репликации подвергается метилированию, это отличительная особенность дочерней ДНК. Метилазы, таким образом, узнают «родную» ДНК, метят ее и проверяют. Метилирование ДНК играет роль в регуляции экспрессии генов (для неактивных генов степень метилирования значительно выше), а также защищает ДНК клетки от атаки нуклеаз. Наиболее часто метилируемыи азотистым основанием является цитозин.

Репарация ДНК.

Репарация генетических повреждений - свойство живых организмов восстанавливать повреждения, возникшие в ДНК В результате воздействия разнообразных, мутагенных факторов как радиационной, так и химической природы. ДНК – единственная макромолекула, кот. способна устранять повреждения, возникшие в ее структуре.

Типы репарации.

Прямая репарация тиминовых димеров и метилированного гуанина.

Прямая репарация – удаление или исправление повреждени на месте, т.е. не происходит разрушения сахарофосфатного остова. У бактерий есть фермент – метилтрансфераза, он перености метильную или этильную группу с алкилированного основания на себя, сам фермент алкилируется и инактивируется. У многих обнаружен фотореактивирующий фермент – фотолиаза, кот. репарирует пиримидиновые димеры, образованные под действием УФ облучения, находит их на ДНК и прочно связывается с ней. При облучении такого комплекса видимым светом, происходит фотохимическая реакция, при которой исчезает димер и восстанавливается нормальная структура ДНК, фермент теряет к ней сродство.