Предисловие

Методические рекомендации составлены с учетом специфики организации учебного процесса на кафедрах ИМО НовГУ и в соответствии с типовыми программами по общей микробиологии.

Рекомендации содержат основные теоретические положения, включающие общие понятия, характеристику физиологических и биохимических аспектов микроорганизмов. Также в них представлены особенности развития, питания, энергетического обмена и других процессов жизнедеятельности микроорганизмов в различных условиях среды. Кроме того, в приложении к рекомендациям предложены таблицы, кратко излагающие данный материал.

Целесообразно использование данных рекомендаций при подготовке к практическим занятиям по общей микробиологии.

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Цель занятия: изучить особенности физиологии бактерий, познакомиться с основными физиологическими и биохимическими процессами и их формами, рассмотреть практическое значение учения о физиологии микроорганизмов.

Основные вопросы

1. Состав бактерий с точки зрения их физиологии.

2. Метаболизм

3. Питание (транспорт питательных веществ)

4. Рост

5. Дыхание

6. Размножение

7. Микробные сообщества (культивировние, идентификация)

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Введение.

Физиология бактерий включает метаболизм бактерий, питание, получение энергии, рост и размножения бактерий, а также их взаимодействие с окружающей средой. Метаболизм бактерий лежит в основе изучения и разработки методов их культивирования, получения чистых культур и их идентификации. Выяснение физиологии патогенных и условно-патогенных бактерий важно для изучения патогенеза вызываемых ими инфекционных болезней, постановки микробиологического диагноза, лечения и профилактики инфекционных заболеваний, регуляции взаимоотношения человека с окружающей средой, а также для использования бактерий в биотехнологических процессах с целью получения биологически активных веществ.

1. СОСТАВ БАКТЕРИЙ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ИХ ФИЗИОЛОГИИ

1. Химический состав бактерий

В состав микроорганизмов входят вода, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, минеральные вещества.

• Вода – основной компонент бактериальной клетки, составляющий около 80 % ее массы. Она находится в свободном или связанном состоянии со структурными элементами клетки. В спорах количество воды уменьшается до 18.20 %. Вода является растворителем для многих веществ, а также выполняет механическую роль в обеспечении тургора. При плазмолизе – потере клеткой воды в гипертоническом растворе – происходит отслоение протоплазмы от клеточной оболочки. Удаление воды из клетки, высушивание приостанавливают процессы метаболизма. Большинство микроорганизмов хорошо переносят высушивание. При недостатке воды микроорганизмы не размножаются. Высушивание в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) прекращает размножение и способствует длительному сохранению микробных особей.

• Белки (40 – 80 % сухой массы) определяют важнейшие биологические свойства бактерий и состоят обычно из сочетаний 20 аминокислот. В состав бактерий входит диаминопимелиновая кислота (ДАП), отсутствующая в клетках человека и животных. Бактерии содержат более 2000 различных белков, находящихся в структурных компонентах и участвующих в процессах метаболизма. Большая часть белков обладает ферментативной активностью. Белки бактериальной клетки обусловливают антигенность и иммуногенность, вирулентность, видовую принадлежность бактерий.

• Нуклеиновые кислоты бактерий выполняют функции, аналогичные нуклеиновым кислотам эукариотических клеток: молекула ДНК в виде хромосомы отвечает за наследственность, рибонуклеиновые кислоты (информационная, или матричная, транспортная и рибосомная) участвуют в биосинтезе белка.

• Углеводы бактерий представлены простыми веществами (моно- и дисахариды) и комплексными соединениями. Полисахариды часто входят в состав капсул. Некоторые внутриклеточные полисахариды (крахмал, гликоген и др.) являются запасными питательными веществами.

• Липиды в основном входят в состав цитоплазматической мембраны и ее производных, а также клеточной стенки бактерий, например наружной мембраны, где, кроме биомолекулярного слоя липидов, имеется ЛПС. Липиды могут выполнять в цитоплазме роль запасных питательных веществ. Липиды бактерий представлены фосфолипидами, жирными кислотами и глицеридами. Наибольшее количество липидов (до 40 %) содержат микобактерии туберкулеза.

• Минеральные вещества бактерий обнаруживают в золе после сжигания клеток. В большом количестве выявляются фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций, магний, а также микроэлементы (цинк, медь, кобальт, барий, марганец и др.).Они участвуют в регуляции осмотического давления, рН среды, окислительно-восстановительного потенциала, активируют ферменты, входят в состав ферментов, витаминов и структурных компонентов микробной клетки.

2. . Ферменты бактерий

Все питательные вещества и любые элементы, подвергающиеся взаимодействиям и превращениям с участием бактерий, вступают в реакции при участии ферментов. Ферменты [от лат. fermentum, закваска], или энзимы [от греч. enzyme, дрожжи или закваска], — специфичные и эффективные белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. За каждое превращение одного соединения в другое ответственен особый фермент.

Функциональная активность ферментов и скорость ферментативных реакций зависят от условий, в которых находится данный микроорганизм и прежде всего от температуры среды и ее pH. Для многих патогенных микроорганизмов оптимальными являются температура 37°С и pH 7,2-7,4.

Физиологические и биохимические функции ферментов бактерий:

• Ферменты снижают энергию активации, обеспечивая протекание таких химических реакций, которые без них могли бы проходить только при высокой температуре, избыточном давлении и при других нефизиологических условиях, неприемлемых для живой клетки.

• Ферменты увеличивают скорость реакции примерно на 10 порядков, что сокращает полупериод какой-либо реакции с 300 лет до одной секунды.

• Ферменты «узнают» субстрат по пространственному расположению его молекулы и распределению зарядов в ней. За связывание с субстратом отвечает определённый участок молекулы ферментативного белка — его каталитический центр. При этом образуется промежуточный фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с образованием продукта реакции и свободного фермента.

• Регуляторные (аллостерические) ферменты воспринимают различные метаболические сигналы и в соответствии с ними изменяют свою каталитическую активность.

Эффекторные ферменты бактерий:

Известно шесть основных классов ферментов, катализирующих следующие реакции: оксидоредуктазы — перенос электронов; трансферазы — перенос различных химических групп; гидролазы — перенос функциональных групп на молекулу воды; лиазы — присоединение групп по двойным связям и обратные реакции; изомеразы — перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм; лигазы — образование связей С-С, C-S, С-О, C-N за счёт реакций конденсации, сопряжённых с распадом аденозинтрифосфата (АТФ).

• Бактерии способны синтезировать все ферменты, необходимые для утилизации широкого спектра питательных субстратов. Определённый субстрат в среде вызывает синтез ферментов, обеспечивающих его катаболизм. В этом случае говорят об индукции катаболических ферментов индуцирующим субстратом (иидуцибельные ферменты). Образование анаболических ферментов в процессах биосинтеза регулируется путём репрессии конечным продуктом (репрессибельные ферменты). Если в среде имеются одновременно два субстрата, то бактерия использует субстрат, обеспечивающий более быстрый рост. Синтез ферментов для расщепления второго субстрата репрессируется; такой вариант известен как катаболитная репрессия. Ферменты, синтезируемые вне зависимости от условий среды, — конститутивные ферменты.

• Определение ферментативной активности бактерий играет огромную роль в их идентификации. Например, все аэробы или факультативные анаэробы обладают супероксид дисмутазой и каталазой — ферментами, защищающими клетку от токсичных продуктов кислородного метаболизма. Практически все облигатные анаэробы не синтезируют эти ферменты. Только одна группа аэробных бактерий — молочнокислые бактерии каталазонегативны, но аккумулируют пероксидазу — фермент, катализирующий окисление органических соединений под действием Н202 (восстанавливается до воды). Наличие аргининдигидролазы — диагностический признак, позволяющий различить сапрофитические виды Pseudomonas от фитопатогенных. Среди пяти основных групп семейства Enterobacteriaceae только две — Escherichiae и Erwiniae— не синтезируют уреазу. Часто вирулентность штамма связана с повышенной активностью ферментов, ответственных за синтез токсинов.

• Получение микробных ферментов — важнейшая отрасль промышленной микробиологии. Например, для улучшения пищеварения применяют готовые препараты ферментов — амилазы, целлюлазы, протеазы, липазы, облегчающих соответственно гидролиз крахмала, целлюлозы, белка и липидов. При изготовлении сладостей для предупреждения кристаллизации сахарозы применяют инвертазу дрожжей, для осветления фруктовых соков — пектиназу. Коллагеназа клостридий и стрептокиназа стрептококков, гидролизующие белки, способствуют заживлению ран и ожогов. Литические ферменты бактерий, секретируемые в окружающую среду, действуют на клеточные стенки патогенных микроорганизмов и служат эффективным средством в борьбе с последними, даже если они обладают множественной устойчивостью к антибиотикам. В качестве инструментария в биоорганической химии, генной инженерии и генотерапии используют выделенные из бактерий рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, полимеразы, ДНК-лигазы и прочие ферменты, направленно модифицирующие нуклеиновые кислоты.

• Одни ферменты микроорганизмов локализуются в их цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве, другие, например гидролазы, выделяются в окружающую среду. На этом основано деление ферментов на экзо- и эндоферменты. Функциональное назначение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде до более простых соединений, которые затем транспортируются в микробную клетку. Некоторые ферменты, локализованные в цитоплазме, функционируют независимо друг от друга, другие тесно связаны между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в определенной последовательности. Внутриклеточные ферменты, объединенные структурно и функционально, составляют мультиферментные комплексы, например ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране.

3. . Пигменты

Многие микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности синтезируют пигменты, различающиеся по цвету, химическому составу и растворимости. Жирорастворимые каротиноидные пигменты красного, оранжевого или желтого цветов образуют сарцины, микобактерии туберкулеза, некоторые актиномицеты. Эти пигменты предохраняют их от действия УФ-лучей. Нерастворимые в воде и даже сильных кислотах пигменты черного или коричневого цвета — меланины — синтезируются облигатными анаэробами Bacteroides niger и др. К пирроловым пигментам ярко-красного цвета относится продигиозин, образуемый некоторыми серациями. Водорастворимые фенозиновые пигменты, например пиоцианин, продуцируются синегнойными бактериями

(Pseudomonas aeruginosa). При этом питательная среда с нейтральным или щелочным pH окрашивается в сине-зеленый цвет. Цвет пигмента используется в качестве теста для идентификации пигментообразующих бактерий.

4. . Светящиеся и ароматобразующие микроорганизмы.

Некоторые бактерии, вибрионы и грибы обладают способностью светиться (люминесцировать). Они вызывают свечение тех субстратов, например чешуи рыб, высших грибов, гниющих деревьев, пищевых продуктов, на поверхности которых размножаются. Большинство светящихся бактерий относятся к галофильным видам, способным размножаться при повышенных концентрациях солей. Они обитают в морях и океанах и редко — в пресных водоемах. Все светящиеся бактерии являются аэробами. Механизм свечения связан с освобождением энергии в процессе биологического окисления субстрата.

Некоторые микроорганизмы вырабатывают летучие ароматические вещества, например уксусно-этиловый и уксусно-амиловый эфиры, которые придают аромат вину, пиву, молочнокислым и другим пищевым продуктам, вследствие чего применяются в их производстве.

2. МЕТАБОЛИЗМ БАКТЕРИЙ

2.1. Основные понятия метаболизма.

Биохимические процессы, протекающие в клетке, объединены одним словом — ме­таболизм (греч. metabole — превращение). Этот термин равнозначен понятию «обмен веществ и энергии». Различают две стороны метаболизма: анаболизм и катаболизм.

Анаболизм — совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки, т. е. та сторона обмена веществ, которую называют конструктивным обменом.

Катаболизм — совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией, необ­ходимой, в частности, и для реакций конструктивного обмена. Поэтому катаболизм определяют еще как энергетический обмен клетки.

Промежуточный обмен веществ, превращающий низкомолекулярные фрагменты питательных веществ в ряд органических кислот и фосфорных эфиров, называют амфиболизм.

Различия в метаболизме у разных групп бактерий нередко используют в качестве фенотипических маркёров при идентификации микроорганизмов. На практике любая схема идентификации неизвестной бактерии включает исследование следующих параметров.

1. Способность к утилизации различных веществ в качестве источника углерода.

2. Способность к образованию специфических конечных продуктов в результате разложения субстратов.

3. Способность смешать рН среды культивирования в кислую или щелочную сторону. Метаболизм большинства бактерий осуществляется посредством биохимических реакций разложения органических (реже неорганических) веществ и синтеза компонентов бактериальной клетки из простых углеродсодержащих соединений.

2.2. Анаболизм (конструктивный обмен).

В конструктивном обмене можно выделить две группы биосинтетических процессов: биосинтез мономеров (аминокислот, нуклеотидов, моносахаров, жирных кислот) и био­синтез полимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов). Для их синтеза необходимо около 70 различных мономеров-предшественников. Помимо них, клетка должна синтезировать ряд соединений, играющих каталитическую роль.

Синтез любого мономера происходит (при наличии источников углерода и энергии) через цепь последовательных биохимических реакций, катализируемых специфическими белками-ферментами. В свою очередь синтез всех биополимеров также требует участия спе­цифических белков. Поэтому основу основ конструктивного обмена составляет биосин­тез белков, который находится под контролем генетической системы организма.

Синтез исходных продуктов происходит в цитоплазме бактериальных клеток. Затем они переносятся на наружную поверхность цитоплазматической мембраны, где начинается морфогенез, т.е. процесс образования определенных клеточных структур (капсула, клеточная стенка и др.; при участии ферментов.

• Биосинтез углеводов. Микроорганизмы синтезируют моно-, оли- го-, полисахариды и другие соединения, в состав которых входят углеводы. Автотрофы синтезируют глюкозу из С 02. При этом С 02 является исходным продуктом для образования рибулозо-1,5-фосфата- 3-фосфорноглицериновой кислоты в цикле Кальвина (схема 2.2.1). Гетеротрофы синтезируют глюкозу из углеродсодержащих соединений с длиной цепи С2 — С3. В обоих случаях используются в основном реакции гликолиза, идущие в обратном направлении. В клетках прокариот, так же как и эукариот, широко развита способность к взаимопревращениям сахаров, которые происходят за счет их нуклеозиддифосфопроизводных. Олиго- и полисахариды синтезируются путем присоединения остатков сахаров от нуклеозиддисахаров к акцепторной молекуле.

• Биосинтез аминокислот. Большинство прокариот способны синтезировать все аминокислоты из пирувата, образующегося в гликоли- тическом цикле, из а-кетоглутарата и фумарата, образующихся в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК). Источниками энергии являются молекулы АТФ. При образовании аминокислот азот вводится в молекулу предшественника на последних этапах биосинтеза при помощи реакций аминирования и переаминирования (схема 2.2.2.).

• Биосинтез липидов. Липиды микроорганизмов представлены жирными кислотами, фосфолипидами, воском, терпенами, каротино- идами, которые содержат длинноцепочечные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты. Важную роль в биосинтезе жирных кислот у микроорганизмов играют так называемые ацетилпереносящие белки. В ходе биосинтеза к ним присоединяются ацильные фрагменты с образованием тио- эфиров. Последовательное удлинение этих фрагментов приводит в конечном счете к образованию высших жирных кислот, содержащих обычно 16-18 углеродных атомов. Некоторые бактерии синтезируют жирные кислоты, содержащие до 24-30 атомов углерода.