9. Бактериологический метод изучения микроорганизмов. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.

Чистой культурой называется популяция бактерий од­ного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающие­ся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по анти­генным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо сим­волами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактерио­логических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.

Колония представляет собой видимое изолированное скоп­ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей мор­фологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагно­стических исследований — идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимиче­ских и других признаков микроорганизма.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питатель­ными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плот­ных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по мор­фологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются на­бором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической прак­тике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определя­ют на дифференциально-диагностических средах.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают вни­мание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент обра­зуют Serratia marcescens, золотистый пигмент — Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент — Pseu-domonas aeruginosa.

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выялвениб соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.

Методы выделения чистых культур бакте­рий.

Универсальным инструментом для производства посевов явля­ется бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом при­меняют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пасте­ровские и градуированные пипетки. Первые предварительно из­готовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец ка­пилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец за­крывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая дру­гими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной ма­териал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней ча­сти среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами над_г писывают, указывая дату посева и характер посевного мате­риала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, пет­лей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Методы культивирования анаэробов.Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз¬дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био¬логических методов.

10. Способы получения энергии бактериями (брожение, дыхание). Типы дыхания бактерий.

Дыхание, или биологическое окисление, основано на окисли­тельно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) во­дорода или электронов; восстановление — присоединение водо­рода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным).

Анаэробиоз (от греч. аег — воздух + bios — жизнь) — жизнедеятельность, протекающая при отсутствии сво­бодного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода яв­ляются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязатель­ные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.

11. Ферменты бактерий. Классификация ферментов: 1) по химической природе; 2) по  генетическому контролю. Методы изучения ферментативной активности бактерий и ее использование для идентификации бактерий.

Ферменты бактерийФерменты (энзимы) – белковые катализаторы живой клетки. Ферменты метаболизма отсутствуют у вирусов. У бактерий обнаружены все 6 классов.Свойства ферментов:

• Ускоряют реакции, которые могут протекать и без них;

• Не входят в состав конечных продуктов реакции и не расходуются в процессе реакции;

• Узко специфичны, избирательно действуют на субстрат.

• Регулируемы. Регуляция ферментативного аппарата – важнейший механизм адаптации к условиям среды;

• Эффективны. Скорость реакции возрастает на несколько порядков.

Классификация ферментов:I.По химической природе:

• Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;

• Трансферазы – ускоряют реакции переноса атомов в ЦТК и пентозофосфатном цикле. Аминотрансфераза и ацилтрансфераза – определяют антибиотикорезистентность бактерий.

• Гидролазы – ускоряют гидролитическое расщепление белков и углеводов. Для некоторых гидролаз субстратом являются органы, ткани живого человека – ферменты агрессии.

Ферменты агрессии:

a. Гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту соединительной ткани;

b. Нейраминидаза – нейраминоваую кислоту слизистых оболочек;

c. Коллагеназа – коллаген мышечных волокон;

d. Лецитиназа – лецитин мембран эритроцитов и мышечных волокон;

e. Протеиназа – иммуноглобулины.

• Лиазы – участвуют в реакциях негидролитического расщепления с образованием двойных связей или присоединение по двойным связям;

• Изомеразы – изомерация соединений;

• Лигазы (синтетазы) – реакция биосинтеза белка.

II. По генетическому контролю:•Конститутивные синтезируются в течении всей жизни микроорганизма (1,2,6 классы);• Адаптивные ферменты (индуцибельные). Синтез индуцируется субстратом (3,4 классы);•Репрессивные. Синтез угнетается избыточным накоплением продуктов реакции.• !Ферментативная активность микроба используется для идентификации и включает три варианта: 1. Сахаролитическая; 2. Протеолитическая (расщепление белков); 3. Гемолитическая.

12. Актиномицеты, их морфология. Роль актиномицетов в инфекционной патологии. Актиномицеты – продуценты антибиотиков.

Морфологическая характеристика актиномицетов (лучистых грибов по старым классификациям). Актиномицеты - формы бактерий, имеющие истинный, не имеющий перегородок мицелий. Мицелиальный (в виде ветвящихся нитей) рост этих грамположительных бактерий придает им внешнее сходство с грибами. Это сходство усиливается вследствие наличия у высших форм актиномицетов наружных неполовых спор, которые называются конидиями. В отличие от грибов, актиномицеты имеют прокариотическое строение клетки, не содержат в клеточной стенке хитина или целлюлозы, размножаются только бесполым путем. У низших актиномицетов мицелий фрагментируется на типичные одноклеточные бактерии. Мицелий актиномицетов подразделяют на субстратный (в субстрате) и воздушный. К мицелиальным бактериям относят микобактерии, рода накардий и актиномицетов, несколько родов высших актиномицет. Представители рода Mycobacterium, в который входят возбудители туберкулеза, являются кислотоустойчивыми микроорганизмами, плохо воспринимающими краски. Их высокая резистентность во внешней среде , кислотоустойчивость и ряд других свойств связан с особым составом клеточной стенки, большим содержанием липидов и воска. У представителей родов Actinomyces и Nocardia мицелий выражен в значительно большей степени, чем у микобактерий, однако в старых культурах они также проявляют тенденцию фрагментироваться на отдельные клетки неправильной формы. Микроорганизмы рода Actinomyces являются анаэробами, Nocardia - аэробами, многие из которых проявляют кислотоустойчивость. Микроорганизмы, относящиеся к высшим актиномицетам (рода Streptomyces, Micromonospora) образуют мицелий и размножаются наружными неполовыми спорами или конидиями. Обычным местом обитания для большинства из них является почва. Однако ряд видов актиномицет и нокардий могут инфицировать раны и вызывать образование абсцессов. Для актиномицетов характерно образование друз - плотных “зерен” в гное, представляющих собой беспорядочно переплетенные в центре нити мицелия с радиально отходящими на периферию колбовидно расширенными на концах “дубинками”. С некоторыми актиномицетами (например, стрептомицетами) связана способность выработки антибиотиков.

Актиномицеты- антибиотики.

Самой богатой антагонистами группой почвенных микроорганизмов оказалась группа лучистых грибков, актиномицетов, а среди них — представители рода Actinomyces . Подавляющее большинство антибиотиков, нашедших применение в медицине и народном хозяйстве, получено именно из этой группы микроорганизмов.

Многочисленными работами советских и зарубежных исследователей установлено, что актиномицеты-антагонисты встречаются в различных природных субстратах, но больше всего их в почве (до нескольких миллионов в 1 г). В некоторых почвах можно обнаружить сравнительно небольшое количество актиномицетов, но почти все они оказываются антагонистами. Установлено, что в окультуренных, хорошо унавоженных почвах встречается больше актиномицетов-антагонистов, чем в почвах целинных, бедных органическим веществом, малоплодородных почвах. Много антагонистов было обнаружено Н. А. Красильниковым в почвах южных засушливых районов. Кроме климатических и географических условий, на содержание актиномицетов-антагонистов в почвах оказывают влияние также сезонность, растительный покров, микробное население, влажность, кислотность и тип почвы, снабжение ее кислородом и много других факторов.

Роль антибиотиков в биоценозах

Одной из характерных особенностей антибиотиков является избирательность действия — каждый антибиотик действует на определенный набор видов микроорганизмов, т. е. имеет свой специфический антимикробный спектр действия. Например, актиномицеты, принадлежащие к виду Actinomyces streptomycini, подавляют рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, микобактерий, некоторых видов дрожжей и грибов. Actinomyces levoris не угнетает рост бактерий, но подавляет развитие дрожжей, некоторых дрожжеподобных организмов, мицелиальных грибов и т. д. Антимикробный спектр действия — один из таксономических признаков в систематике актиномицетов, служащих для разграничения видов. Вырабатываемые актиномицетом антибиотики не угнетают развития собственной культуры даже в концентрациях, которые во много раз превышают минимальную концентрацию, подавляющую рост других микроорганизмов.

Какова же биологическая роль антибиотиков? На этот вопрос однозначного ответа нет. Советские и многие зарубежные ученые считают, что способность синтезировать антибиотики — полезное для вида приспособление, выработавшееся и закрепленное в процессе эволюции организмов. Продуцирование антибиотиков — один из факторов, дающий определенные преимущества микроорганизму-антагонисту в борьбе за существование в сложных естественных микробных ассоциациях. Согласно другой точке зрения, антибиотики представляют собой «отбросы» обмена веществ у микроорганизма, не играющие приспособительной, эволюционной роли. Эта точка зрения разделяется 3. Ваксманом, X. Лешевалье и некоторыми другими зарубежными исследователями. Свою трактовку они обосновывают главным образом тем, что, во-первых, антибиотики образуются не всеми широко распространенными микробами; во-вторых, антибиотики быстро инактивируются в почве. Но продуцирование антибиотиков — лишь одно из приспособлений, выработанное микробами в борьбе за существование. Антагонизм микробов может обусловливаться и рядом других веществ, помимо антибиотиков, а также приспособительными механизмами, не связанными с образованием каких-либо химических соединений. Все это также может способствовать широкому распространению микробов, у которых не выявлена способность синтезировать антибиотики. К этому же следует добавить, что в лабораторных условиях, когда тот или иной актиномицет выращивают изолированно (вне естественного микробного сообщества) на искусственных питательных средах, не всегда удается выявить способность к синтезу антибиотика. То есть неактивные в лабораторных условиях штаммы актиномицетов способны к биосинтезу антибиотиков.