Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «ПЕРМСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени академика Е.А. Вагнера федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

С.В. Поспелова, м.В. Кузнецова Полимеразная цепная реакция Методические рекомендации

Пермь 2007

УДК 616-078.33

ББК 53.4

Авторы:

С.В. Поспелова – канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, М.В. Кузнецова – канд. биол. наук, сотрудник ИЭГМ УрО РАН

Поспелова, С.В.

Полимеразная цепная реакция: метод. рекомендации / С.В. Поспелова, М.В. Кузнецова; ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава. – Пермь, 2007. – 35 с.

Предназначены для самостоятельной работы студентов всех факультетов: лечебного, педиатрического, медико-профилактического, стоматологического и факультета высшего сестринского образования (ФВСО) медицинской академии.

Рецензент:

зав. кафедрой биологии, экологии и медицинской генетики ПГМА, профессор А.Б. Виноградов

Печатается по решению центрального координационного методического совета ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава

УДК 616-078.33

ББК 53.4

© Поспелова С.В., Кузнецова М.В., 2007

© ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Ваг­нера Росздрава, 2007

Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике

Современная медицина успешно использует достижения естественных наук, интенсивно применяет новые технологии для диагностики и лечения заболеваний. В последнее время к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий. Применение этих методов не только в научных целях, но и в практической лабораторной диагностике стало возможным в немалой степени благодаря созданию в середине 80-х годов процесса искусственного многократного копирования ДНК и дальнейшему стремительному развитию этой технологии, в настоящее время известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Менее чем за 15 лет своего существования ПЦР сделала рутинным анализ специфических ДНК-последовательностей многих пато­генных микроорганизмов. Универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым для решения различных задач клинической диагностики, таких как прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний, молекулярное типирование и исследование свойств патогенных микроорганизмов, анализ мутаций, связанных с генетическими заболеваниями у человека, идентификация личности человека.

Что такое пцр?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro (рис. 1). Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом - ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК «с нуля», ей необходима короткая «затравочная» цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.

В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «ограничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов:

1) денатурации, или «плавления» двуцепочечной ДНК: перед началом реакции ДНК-мишень является двуцепочечной, при температуре 94-95⁰ С комплиментарные цепи ДНК расходятся - переходят в одноцепочечное состояние;

2) связывания (отжига) праймеров: при температуре, оптимальной для выбранных праймеров, происходит их связывание с комплиментарным участком матричной ДНК;

3) элонгации, или удлинения цепи: ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к праймерам, синтезируя новые цепи ДНК, которые становятся мишенью для праймеров в последующих циклах ПЦР.

Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси (см. рис. 1).

Рис. 1. Основные этапы цикла ПЦР

Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в предыдущих циклах. При этом количество основного продукта ПЦР (копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически удваивается в каждом цикле. Если на начальном цикле в исследуемом материале была только одна ДНК-мишень, после первого цикла будет уже две копии, после двух циклов – 4 копии, результатом третьего цикла будет 8 копий, а тридцать пятого – уже 68 биллионов копий (рис. 2).

Рис. 2. Процесс многократного копирования ДНК-мишени в ходе последовательно сменяющихся циклов

Основным методом анализа продуктов реакции, который традиционно применяется во многих лабораториях для обнаружения амплифицированной ДНК и определения ее размера, является метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем, специфичным к ДНК, например бромистым этидием (рис. 3).

Контроль – различные фрагменты ДНК с известным количеством составляющих их нуклеотидов. Известно, что дистанция между различными фрагментами имеет логарифмическую зависимость от их размера, массы. Линия 1 – обнаружены ПЦР-фрагменты длиной приблизительно 1850 оснований. Линия 2 и 4 – фрагменты длиной около 800 оснований.

Рис. 3. Анализ продуктов реакции методом гель-электрофореза

Линия 3 – не выявлены искомые фрагменты, отрицательный результат реакции. Линия 5 – множественные линии сформировались потому, что праймеры оказались комплиментарны к нескольким фрагментам ДНК различной длины: около 550, 800 и 1500 оснований.