Петровский Б.В., Перельман М.И. - Аутотрансплантация лёгкого в эксперименте

Следовательно, в ткани легкого при консервации в условиях гипотермии (+4°) активность сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы сохранялась в течение 48 часов, а глютаматдегидрогеназы — в течение 24 часов. В последующие сроки активность ферментов цикла Кребса значительно снижалась, определялись лишь конгломераты, состоящие из крупных зерен и глыбок диформазана.

Гликолитический цикл. Для характеристики этого цикла было произведено определение активности 3 ферментов: алкоголъдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегидрогеназы.

До консервации в ткани легкого отмечалась умеренная актив­ ность ферментов в виде мелких зерен диформазана в эпителии бронха и слизистых желез, в клетках альвеолярных перегородок зерна диформазана располагались неравномерно. После консерва­ ции ткани легкого в течение 24 и 48 часов умеренная активность ферментов гликолитического цикла отмечалась в виде мелких не­ равномерных зерен диформазана в эпителии бронхов, кроме алкогольдегидрогеназы, активность которой в эпителии бронхов умень­ шалась уже после 24 часов консервации. Через 72 и 96 часов кон­ сервации отмечалась очень низкая активность ферментов гликоли­ тнческого цикла. Диформазан определялся в виде крупных кон­ гломератов, состоящих из грубых зерен (рис. 137).

Таким образом, проведенное гистохимическое исследование ткани легкого при консервации в условиях гипотермии (при +4°) отражало активность и локализацию основных циклов окислитель­ но-восстановительных процессов. Эти исследования показали, что в течение первых 24 часов существенных изменений в активности и локализации дегидрогеназ не наблюдалось. Лишь после 48 часов консервации ткани легкого снижалась активность ферментов, о чем свидетельствовало уменьшение количества зерен диформаза­ на в эпителии бронхов и исчезновение зерен в стенке альвеоляр­ ных перегородок. Зерна диформазана в эти сроки располагались неравномерно. После 72 часов они были представлены в виде от­ дельных крупных и грубых зерен и конгломератов зерен, что сви­ детельствовало о нарушениях окислительно-восстановительных процессов в ткани легких при этих сроках консервации.

Энергетические функции митохондрий легкого при консервации

Изучение метаболизма ткани легкого при консервации имеет определенное значение в комплексной оценке пригодности легко­ го для последующей трансплантации.

В литературе имеется очень мало сообщений об исследованиях метаболизма ткани легкого при консервации. А. А. Игнатенок

(1970) установил электрометрическим методом снижение потреб­ ления кислорода тканью легкого при консервации от 1 до 6 су­ ток. К. А. Годзоева (1970) при изучении тканевого дыхания лег­ кого, консервированного при температуре + 3 ° или при сочетании: с 3 ата 02 , обнаружила через 24 часа резкое повышение потребле­ ния 02 , тогда как утилизация неорганического фосфора падала. Через 48 часов потребление 02 и утилизация фосфора снижались,, приближаясь к нулю к 72 часам. Содержание молочной кислоты, наоборот, нарастало начиная с 24 часов. Годзоева считала, что че­ рез 72 часа, когда усиливался распад гликогена и образование мо­ лочной кислоты, а дыхательный коэффициент становился значи­ тельно меньше единицы, можно было говорить о начавшемся рас­ паде белков. J. Takeda (1968) установил, что при консервации:

Автор высказал предположение, что этот метод может служить одним из показателей жизнеспособности легкого при консерва­ ции.

В настоящее время появляется все больше доказательств того, что функциональное состояние ткани определяется энергетичес­ ким метаболизмом в митохондриях, ответственных за энергоснаб­ жение ткани. В связи с этим представлялось интересным сравнить способность митохондрий легкого к окислению и фосфорилированию непосредственно после удаления легкого и при его консер­ вации.

В этом разделе изложены результаты полярографического из­ мерения скоростей потребления кислорода митохондриями в раз­ ных метаболических состояниях1 .

Были измерены скорости потребления кислорода митохондрия­ ми легкого в метаболических состояниях: втором (дыхание в сре­ де с субстратом окисления), третьем (дыхание в среде с субстра­ том окисления и акцептором фосфата АДФ), четвертом (дыхание после превращения добавленной АДФ в АТФ) и при разобщении окисления и фосфорилирования 2,4-динитрофенолом. Полученные результаты приведены на диаграммах (рис. 138).

Митохондрии, выделенные из только что удаленного легкого, на добавку АДФ отвечали увеличением скорости потребления кис­ лорода в 2,5 раза (рис. 138, А). Фосфорилирование 0,4 мкг-моле- кулы АДФ длилось 3,3 минуты, после чего митохондрии перехо­ дили в четвертое метаболическое состояние. Коэффициент фосфо­ рилирования АДФ/О равнялся 2,7. Добавление 0,04 мкг-моле^- кулы ДНФ приводило к увеличению скорости потребления кисло-

1Исследования проведены в ЦНИЛ им. С. И. Чечулина 1-го ММИ совместно

сканд. биол. наук С. В. Елисеевой и канд. физ.-мат. наук К. И. Ко.товой..

'294 Глава девятая

рода до величины, имевшей место в третьем состоянии. Все это свидетельствовало о наличии сопряжения окисления и фосфори­ лирования в митохондриях легкого Собаки.

Через 1 минуту после добавления ДНФ скорость потребления кислорода снижалась, что связано с торможением дыхания щавелевоуксусной кислотой, так как торможение устранялось после добавления глютаминовой кислоты.

Обращала на себя внимание высокая скорость потребления кислорода митохондриями в течение 1 —1,5 минуты. Возможно, такое усиление связано с накоплением АДФ в митохондриях за время их выделения и хранения вследствие деятельности АТФаз, которых особенно много в ткани легкого (Диксон, Уэбб, 1966; Збарский, 1955; Павлова, 1962), и с ее фосфорилированием при введении митохондрий в среду инкубации с сукцинатом.

Через сутки консервации добавка АДФ вызывала примерно такое же увеличение скорости потребления кислорода (см. рис. 138, Б) . Скорости потребления кислорода в третьем состоянии и при добавлении ДНФ по-прежнему были равны, причем их ве­ личины были близки к таковым для митохондрий из только что удаленного легкого. Однако время фосфорилирования добавляе­ мой АДФ увеличивалось.

Через двое суток консервации (см. рис. 138, В) скорость по­ требления кислорода митохондриями в третьем состоянии уже не­ сколько снижалась. Время фосфорилирования добавляемой АДФ увеличивалось примерно в 2 раза: 3 минуты длилось фосфорилирование половинной дозы АДФ (0,2 микрограмм-молекулы). Ко­ эффициент фосфорилирования АДФ/О снизился до 2,2. Скорость потребления кислорода после добавления ДНФ выше скорости в третьем состоянии. Все это говорило о начавшихся повреждениях в цепи накопления энергии. Однако можно думать, что цепь транс­ порта электронов к этому сроку еще не была затронута, посколь­ ку скорости потребления кислорода во втором состоянии и при добавлении ДНФ имели значения, близкие к исходным.

Через 3 суток консервации ткани легкого наблюдались сущест­ венные повреждения окислительного фосфорилирования (см. рис. 138, Г). Добавление АДФ не вызывало стимуляции дыхания, т. е. налицо было полное разобщение окисления и фосфорилиро­ вания. Добавление ДНФ продолжало вызывать стимуляцию дыха­ ния, однако величина скорости потребления кислорода значитель­ но снизилась, что в совокупности со снижением скорости во вто­ ром состоянии свидетельствовало о нарушениях и в процессах транспорта электронов.

.

Известно, что стенка альвеолы состоит из клеток поверхност­ ного легочного эпителия (малые клетки) с одной стороны, грани­ чащих с воздушным пространством альвеолы, а с другой — плотно примыкающих к базальной мембране альвеолярных клеток (боль­ шие клетки) и эндотелия мелких кровеносных капилляров.

Малые альвеолярные клетки или клетки поверхностного ле­ гочного эпителия содержат ядро округлой или овальной формы, которое занимает почти всю уплощенную клетку. В сторону от клетки отходят цитоплазматические отростки, в которых сравни­ тельно редко встречаются мелкие округлые митохондрии.

Наиболее характерной особенностью больших альвеолярных клеток является наличие в их цитоплазме крупных осмиофильных тел, в матриксе которых располагаются мембранные структу­ ры. В центре клетки находится округлое ядро, митохондрии име-

Ei настоящее время считается, что осмиофильные тела больших альвеолярных клеток содержат лшгопротеины и служат для фор­ мирования липопротеиновои пленки, выстилающей поверхность альвеолы. Основное назначение этой пленки — поддерживать по­ верхностное натяжение альвеолы и препятствовать проникновению жидкости в ее просвет, она также предохраняет цитоплазму кле­ ток, составляющих альвеолу, от подсыхания и облегчает газооб­ мен. Кроме того, липопротеиновая пленка поверхности альвеолы обладает бактерицидными свойствами, лизируя микроорганизмы (Macklin, 1954; Pattle et al., 1961; Comroe, 1962).

Структура эндотелиальных клеток капилляров легкого имеет типичное строение. Околоядерная расширенная часть эндотели­ альных клеток содержит мелкие митохондрии, аппарат Гольджи,

элементы гранулярного и агранулярного эндоплазматического ретикулума, гранулы гликогена и рибосомы. Истонченные части этих клеток, как правило, лишены клеточных органелл и содержат большое число пиноцитозных пузырьков.

Исследование ультраструктуры нормального легкого собаки до консервации свидетельствует, что цитоплазматические отростки клеток альвеолярного эпителия содержат небольшое количестве клеточных органелл. Цитоплазматические отростки плотно приле­ гают к базальной мембране, а с другой стороны к базальной мем­ бране примыкают цитоплазматические отростки эндотелия капил­ ляров. Между эндотелиальными и альвеолярными клетками нахо­ дятся пучки коллагеновых волокон. В цитоплазме альвеолярных клеток находится лопастное ядро, митохондрии, имеющие неболь­ шое число крист и плотный матрикс, цитоплазматические гранулы, пузырьки агранулярного эндоплазматического ретикулума, круп­ ные осмиофильные тела (рис. 139).

Рис. 142. Легкое собаки после консервации в течение 2 часов при + 4 и. отсроченной аутотрансплантации

а—ультраструптура стенки альвеолы, Х15000; б— видны отростки альвеолярных клеток, содержащие набухшие митохондрии, У.10 000; ПП — пиноцитозные пузырьки; остальные обозначения те же, что па рис. 139—Ш

В большой альвеолярной клетке располагается лопастное ядро, плотные осмиофильные тельца, ограниченные мембраной, в матриксе которых видны плотные пластинчатые структуры, имеется

Участок альвеолярной стенки содержит капилляры, между ко­ торыми располагаются отростки клеток альвеолярного эпителия и фибробласты. Цитоплазма фибробластов занята развитым грану­ лярным эндоплазматическим ретикулумом (рис. 141).

После отсроченной аутотрансплантации с консервацией в те­ чение 2 часов изменения ультраструктурной организации легкого незначительны. Ультраструктура большинства клеток альвеолы не изменена по сравнению с таковой интактного легкого, хотя встре­ чаются отдельные клетки с некоторыми нарушениями ультра­ структурной организации. Митохондрии некоторых клеток поверх­ ностного легочного эпителия набухают, наблюдается небольшая