Групповые системы эритроцитов. Групповая система ав0 и групповая система резус. Методы определения групп крови по системам ав0 и резус.

В зависимости от наличия в эритроцитах агглютиногенов А и В, а в сыворотке соответствующих им агглютининов α и β, все люди разделены на четыре группы:

Группа О (I) — в эритроцитах агглютиногенов нет, в сыворотке агглютинины α и β.

Группа А (II) — в эритроцитах агглютиноген А, в сыворотке агг­лютинин β.

Группа В (III) — в эритроцитах агглютиноген В, в сыворотке агг­лютинин α.

Группа АВ (IV) — в эритроцитах агглютиногены А и В, агглюти­нинов в сыворотке нет.

В последнее время в системе АВ0 обнаружены разновидности клас­сических антигенов А и В, а также другие антигены.

В основе определения групповой принадлежности крови лежит реакция прямой гемагглютинации при комнатной температуре, развивающаяся при встрече одноименных агглютининов и агглютиногенов.

Для определения группы крови по системе АВ0 существуют 3 способа:

1. с применением стандартных сывороток, содержащих естественные агглютинины в достаточном титре, позволяющих установить, какие агглютиногены содержатся в эритроцитах испытуемой крови;

2. с применением гибридомных препаратов, содержащих иммунные антитела анти-А, анти-В и анти-АВ, также позволяющих обнаружить агглютиногены А и В в эритроцитах испытуемой крови;

3. с помощью стандартных сывороток и стандартных эритроцитов (перекрестный способ). В этом случае одновременно определяются как агглютиногены, так и агглютинины крови, что позволяет дать наиболее полную групповую характеристику испытуемой крови.

При использовании первого и третьего способов берут 2 серии сывороток (контроль сыворотки) во избежание получения ошибочных результатов.

Определение групповой принадлежности крови с помощью стандартных сывороток.

На тарелку, пластинку, планшет с белой смачивающейся поверхностью под написанные стеклографом обозначения первых 3 групп крови наносят большие капли стандартных гемагглютинирующих сывороток первых 3-х групп в 2-х сериях. Каждая сыворотка берется отдельной пипеткой. Всего, таким образом, получается 6 капель сывороток (по 3 капли в 2 рядах).

Рядом с каплями сывороток помещают по маленькой капле испытуемой крови (капля крови должна быть в 5-10 раз меньше капли сыворотки).

Чистой сухой стеклянной палочкой смешивают капли крови с сывороткой, чтобы смесь окрасилась в равномерный красный цвет. Для каждой капли используют отдельную стеклянную палочку. Можно для смешивания использовать и уголки предметного стекла.

После смешивания капель пластинку покачивают 2-3 минуты, затем оставляют на 2 мин. в покое и снова покачивают, наблюдая за ходом реакции. Время реакции должно быть не менее 5 минут.

По истечении 3 минут в капли, добавляют по маленькой капле изотонического раствора хлорида натрия при медленном покачивании пластинки (тарелки, планшета).

Учитывают полученные результаты через 5 минут.

Трактовка результатов.

Реакция гемагглютинации может быть положительной и отрицательной.

При положительной реакции после смешивания испытуемой крови с сывороткой образуются мелкие хлопья агглютинатов, которые, сливаясь между собой, образуют большие хлопья, видимые невооруженным глазом. При этом сыворотка становится бесцветной или почти бесцветной.

В случаях отрицательной реакции смесь сыворотки и крови остается равномерно окрашенной в красный цвет в течение всего времени наблюдения, а агглютинаты в ней не обнаруживаются.

Обязательным условием правильной трактовки исследования является совпадение результатов реакции с сыворотками одной и той же группы разных серий.

При проведении описанного исследования возможны 4 варианта сочетаний положительных и отрицательных результатов:

Во всех каплях смесь эритроцитов испытуемой крови и стандартных сывороток окрашена в однородный красный цвет и нигде агглютинация не определяется, т.е. реакция агглютинации оказывается отрицательной во всех 6 каплях. Это свидетельствует об отсутствии в эритроцитах испытуемой крови агглютиногенов α и β, т.е. – о принадлежности ее к О (I) группе.

Если реакция агглютинации развилась при смешивании испытуемой крови с сыворотками О (I) и В (III) групп, - значит, в эритроцитах испытуемой крови содержится агглютиноген α, т.е. она принадлежит к группе А (II).

В случаях агглютинации эритроцитов испытуемой крови стандартными сыворотками О(I) и А (II) групп можно утверждать о том, что на оболочке эритроцитов имеется агглютиноген β, т.е. кровь относится к В(III) группе.

Если агглютинация произошла во всех каплях, - это может свидетельствовать о наличии в эритроцитах испытуемой крови агглютиногенов α и β, но утверждать это можно только исключив неспецифическую агглютинацию, для чего в таких случаях проводится обязательное контрольное исследование с сывороткой IV группы. Если при этом реакция агглютинации не развивается, можно с уверенностью отрицать неспецифическую агглютинацию в предшествовавшем опыте и отнести испытуемую кровь к АВ (IV) группе.

Определение групповой принадлежности крови с помощью цоликлонов.

Применение цоликлонов так же, как и использование поликлональных сывороток, позволяет определить групповую принадлежность крови по системе АВ0, благодаря обнаружению агглютиногенов эритроцитов в реакции прямой гемагглютинации.

Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ представляют собой моноклональные антитела класса М, продуцируемые мышиными гибридомами.

1) На плоскость наносятся отдельными пипетками большие капли цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ под соответствующими надписями.

2) Рядом с каплями реагентов наносят в 10 раз меньшие капли исследуемой крови (по одной капле крови рядом с каждой каплей реагента).

3) Кровь смешивается с реагентами отдельными стеклянными палочками.

4) Пластина или планшет покачиваются в течение 3 минут.

5) Учитывают реакцию.

Трактовка результатов.

Возможно получение 4 вариантов результатов исследования:

1) Если реакция агглютинации не развилась с цоликлонами анти-А, анти-В и анти-АВ, - то исследуемую кровь следует отнести к 0 (I) группе, так как ее эритроциты не содержат агглютиногенов А и В.

2) Если реакция агглютинации отмечена после смешивания капли исследуемой крови с реагентами анти-А и анти-АВ, - значит, эритроциты содержат агглютиноген А, а исследуемая кровь должна быть отнесена к группе А(II). При этом агглютинация с цоликлоном анти-В отсутствует.

3) Если наблюдается реакция агглютинации с цоликлонами анти-В и анти-АВ, но отсутствует с цоликлоном анти-А, - исследуемая кровь относится к В(III) группе, так как ее эритроциты содержат агглютиноген В.

4) Если наблюдается положительная реакция агглютинации во всех 3 каплях, где смешаны реагенты с каплями испытуемой крови, - эритроциты исследуемой крови содержат агглютиногены А и В, а значит, кровь относится к АВ (IV) группе. Но для обоснованного утверждения этого факта необходимо исключить спонтанную неспецифическую реакцию. Для этого следует произвести смешивание капли исследуемой крови с каплей изотонического раствора хлорида натрия на плоскости. При отсутствии агглютинации в контрольном исследовании исследуемая кровь с уверенностью может быть отнесена к АВ (IV) группе.

Определение групповой принадлежности крови перекрестным способом.

Этот метод определения групповой принадлежности крови предполагает одновременное определение как агглютиногенов в эритроцитах исследуемой крови, так и агглютининов, содержащихся в ее плазме или сыворотке. В качестве диагностикумов используют как стандартные гамагглютинирующие сыворотки, так и стандартные эритроциты с известной групповой принадлежностью.

1) Под предварительно сделанными обозначениями на пластинке с белой смачивающейся поверхностью наносят большие капли стандартных гемагглютинирующих сывороток первых 3 групп в двух сериях. Капли сывороток должны быть объемом не меньше 0,1 мл. Таким образом, получаются 6 капель, располагающихся в 2 ряда.

2) На нижнюю часть пластинки, также под соответствующими обозначениями, наносят маленькие капли (0,01 мл) взвеси стандартных эритроцитов первых 3 групп.

3) Из пробирки, содержащей центрифугированную испытуемую кровь, пипеткой извлекают сыворотку (плазму) и смешивают большие капли плазмы (сыворотки) объемом 0,1 мл со стандартными эритроцитами.

Теми же пипетками наносят маленькие (0,01 мл) капли осадка эритроцитов испытуемой крови рядом с каплями стандартных гемагглютинирующих сывороток.

4) Капли, в которых смешаны эритроциты испытуемой крови со стандартными сыворотками, и плазма испытуемой крови со стандартными эритроцитами, перемешивают раздельными стеклянными палочками, пластинку покачивают, затем оставляют в покое 1-2 минуты и снова покачивают. Наблюдение за развивающейся реакцией проводят не менее 5 минут.

5) По истечении 3 минут во все капли, добавляют по капле физраствора, снова покачивают пластинку для лучшего смешивания реагентов и учитывают результаты через 5 минут.

Трактовка результатов.

Трактовка результатов предполагает сравнение результатов взаимодействия стандартных эритроцитов с плазмой испытуемой крови и стандартных гемагглютинирующих сывороток с эритроцитами крови, групповая принадлежность которой должна быть установлена. Возможны 4 комбинации:

1) При взаимодействии со стандартными сыворотками эритроцитов испытуемой крови агглютинация не развилась ни в одной из проб. Это свидетельствует об отсутствии в эритроцитах агглютиногенов А и В. При смешивании стандартных эритроцитов с плазмой испытуемой крови агглютинации нет только с эритроцитами 0(I) группы, а есть - с эритроцитами А(II) и В(III) групп. Последнее подтверждает принадлежность испытуемой крови к 0(I) группе, т.к. указывает на наличие в ее сыворотке агглютининов альфа и бета.

2) При взаимодействии эритроцитов испытуемой крови со стан­дарт­ными сыворотками произошла агглютинация с сыворотками 0(I) и В(III) групп при отсутствии иммунного склеивания эритро­цитов в капле сыворотки А(II) группы. Это свидетельствует о наличии в эритроцитах испытуемой крови агглютиногена А. Сыворот­ка (плазма) испытуемой крови дает агглютинацию со стандартными эритроцитами В(III) группы, а с эритроцитами 0(I) и А(II) - нет. Это подтверждает принадлежность испытуемой крови к А(II) группе, т.к. свидетельствует о наличии в сыворотке агглютинина бета.

3) При положительной реакции агглютинации со стандартными сыворотками 0(I) и А(II) групп констатируется наличие в эритроцитах испытуемой крови агглютиногена В, т.е. утверждается ее принадлежность к В(III) группе. При смешивании сыворотки (плазмы) испытуемой крови со стандартными эритроцитами реакция агглютинации оказывается отрицательной с эритроцитами 0(I) и В(III) групп, но положительной с эритроцитами А(II) группы. Таким образом обнаруживается наличие в сыворотке испытуемой крови агглютинина альфа, что подтверждает принадлежность испытуемой крови к В(III) группе.

4) При смешивании эритроцитов испытуемой крови со стандартными сыворотками получают реакцию агглютинации во всех 6 каплях, где происходило смешивание исследуемых эритроцитов с сыворотками первых 3 групп в 2 сериях. При контрольном исследовании с сывороткой АВ(IV) группы реакция агглютинации оказывается отрицательной, что позволяет говорить о принадлежности испытуемой крови к АВ(IV) группе. Исследование результатов взаимодействия сыворотки (плазмы) исследуемой крови со стандартными эритроцитами во всех случаях покажет отсутствие агглютинации, что свидетельствует об отсутствии естественных агглютининов против агглютиногенов А и В в плазме испытуемой крови, т.е. подтвердит ее принадлежность к АВ (IV) группе.

Определение резус-принадлежности крови

В настоящее время существует несколько способов определения резус-принадлежности крови (констатации наличия или отсутствия Rh₀D антигена в эритроцитах. Следует отметить, что наибольшую роль в трансфузиологии играет резус-фактор D (Rh₀ D), поэтому обычно применяемые пробы на резус-принадлежность выявляют именно эту разновидность резус-антигена.

Определение резус-принадлежности с помощью цоликлона анти-Д-Супер.

Действующим началом этого препарата являются моноклональные полные антирезусные антитела, относящиеся к классу Ig M.

1. Определение резус-принадлежности на плоскости.

На пластинку со смачивающейся поверхностью наносят 1 каплю Цоликлона Анти-D-Cynep.

Рядом помещается в 5-10 раз меньшая по объему капля испытуемой крови или взвеси эритроцитов.

Кровь (взвесь эритроцитов) смешивают с реагентом.

Через 20-30 секунд после смешивания пластинку слегка покачивают в течение 3 минут.

Учитывают результаты путем осмотра невооруженным глазом.

Трактовка результатов.

Появление агглютинации при смешивании испытуемой крови с реагентом свидетельствует о том, что эритроциты крови содержат антиген Rh₀D, т.е. являются резус-положительными. При отсутствии агглютинации исследуемая кровь расценивается как резус-отрицательная.

Определение резус-фактора Rh₀(D) реакцией конглютинации с применением желатина.

В 2 пробирки вносят по 1 капле взвеси исследуемых эритроцитов и по 2 капли 10% раствора желатина, подогретого до 46-48 градусов до разжижения.

В одну из пробирок добавляют 2 капли группоспецифической (т.е. относящейся к той же группе по системе АВО, что и исследуемые эритроциты) антирезусной человеческой сыворотки. В другую пробирку сыворотку не добавляют (она служит для контроля специфичности агглютинации)

Параллельно таким же образом в отдельных маркированных пробирках исследуют стандартные резус- положительные и резус-отрицательные эритроциты (их смешивают с антирезусной сывороткой и раствором желатина, как описано в предыдущих пунктах).

Содержимое пробирок перемешивают и пробирки помещают на водяную баню при температуре 46-48 градусов на 15 минут или в термостат при такой же температуре на 30 минут.

По истечении указанного времени пробирки извлекают из термостата (водяной бани) и добавляют в каждую из них по 5-8 мл физраствора, с которым содержимое пробирок тщательно перемешивают.

Оценивают результаты просматриванием пробирок в проходящем свете невооруженным глазом или через лупу с 2-5-кратным увеличением.

Трактовка результатов.

При положительном результате (исследуемые эритроциты резус-положительны и дают реакцию агглютинации с антирезусными сыворотками) агглютинаты хорошо заметны на фоне почти обесцвеченной жидкости. При отрицательном результате жидкость в пробирке со взвесью испытуемых эритроцитов окрашена в равномерный красный или розовый цвет, а хлопья агглютинатов не выявляются. Результат учитывают как истинный при наличии агглютинации в параллельном опыте со стандартными резус-положитель­ными эритроцитами и при отсутствии агглютинации в опыте со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, а также - в пробирке, содержащей только исследуемые эритроциты и желатин (контроль специфичности реакции).

Положительный результат свидетельствует о том, что эритроциты испытуемой крови содержат резус-антиген (т.е.являются резус-положительными), а отрицательный - о том, что исследуемые эритроциты не содержат резус-антигена, т.е. являются резус-отрицательными.

Дополнение. Для исследования можно применять как нативную кровь, так и в смеси с консервантом, но в последнем случае консервант необходимо отмыть десятикратным объемом изотонического раствора хлорида натрия. Кроме того, в каждом случае определения резус-принадлежности этим способом следует использовать группоспецифические антирезусные сыворотки 2 серий (контроль сыворотки).

Определение резус-принадлежности с помощью универсального антирезусного реагента Rh₀(D).

Универсальный антирезусный реагент представляет собой человеческую сыворотку, содержащую антирезусные антитела, но лишенную антител альфа и бета, - почему она и может быть использована для определения резус-принадлежности крови любой группы системы АВО. С целью обеспечения протекания реакции в нее добавляют 33% раствор полиглюкина или 20% раствор альбумина

В коническую пробирку помещают 1 каплю исследуемой крови или взвеси эритроцитов.

Добавляют 2 капли универсального антирезусного реагента и смешивают с исследуемой кровью.

Наклоняют пробирку с тем, чтобы содержимое ее растекалось по стенкам, и медленно вращают пробирку вокруг вертикальной оси для лучшего контакта эритроцитов и реагента в течение 5 минут.

По истечении 5 минут добавляют 2-3 мл изотонического раствора хлорида натрия и перемешивают (не взбалтывая) содержимое пробирки.

Учитывают результат, рассматривая содержимое пробирки в проходящем свете невооруженным глазом.

Трактовка результатов.

При наличии агглютинатов и просветлении жидкости в пробирке исследуемые эритроциты содержат Rh ₀(D) антиген, а испытуемая кровь является резус-положительной. При отсутствии агглютинатов и розовой окраске жидкости, дающей при встряхивании пробирки перламутровый отлив, - исследуемая кровь является резус-отрицатель­ной.