МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНЕТИКА

было постулировано Менделем. В процессе развития хромосомной теории наследственности было показано, что гены это хромосомные локусы,

которые одновременно являются единицами мутации, рекомбинации и функции. С возникновением молекулярной генетики появилось представление о гене, как единице транскрипции. С этой точки зрения гены – это транскрибируемые участки молекулы ДНК. Какова же их структура?

Рисунок 21. Структура генов эукариот Напомним, что многие гены эукариот, включая человека, имеют

прерывистую структуру – рис. 21. Кодирующие участки гена - экзоны,

соседствуют с протяженными некодирующими участками – интронами,

которые вырезаются при процессинге преРНК и, таким образом, не участвуют в трансляции. Некоторые экзоны, локализованные на концах гена,

транскрибируются, но также не транслируются. Экзоны относятся к числу

смысловых последовательностей, так как в них, в отличие от интронов или каких-то других последовательностей ДНК, нет стоп-кодонов, то есть они составляют открытые рамки считывания. На границах между экзонами и интронами локализованы важные канонические последовательности, так называемые сайты сплайсинга, необходимые для правильного вырезания интронов.

Заметим, что открытие мозаичной структуры генов эукариот оказалось совершенно неожиданным и относится к разряду мини-революции в генетике. Термины экзон и интрон были введены Уолтером Гилбертом в

1978 году и сразу были приняты научным сообществом, хотя до сих пор нет удовлетворительных объяснений, зачем нужна прерывистость структуры генов, почему она появляется у высших организмов и какие преимущества она им дает. С другой стороны, очевидно, что эволюционный прогресс эукариот в значительной степени ассоциирован с появлением мозаичных генов. В отличие от белок-кодирующих последовательностей численность и

протяженность интронов прямо коррелируют со сложностью организации жизни. У одноклеточных эукариот, таких, например, как дрожжи, интроны занимают от 10 до 20% преРНК, их средняя длина менее 100 нуклеотидов и они распределены с плотностью 1-3 на 1000 нуклеотидов экзонов. В генах высших растений от 2 до 4 интронов, их длина составляет около 250

нуклеотидов и они занимают до 50% пре-РНК. У животных средняя длина интронов увеличивается до 500 пар оснований у дрозофилы или нематоды и до 3400 нуклеотидов у человека, в среднем, их 6-7 на ген, и они занимают более 95% от общей длины первичного РНК-транскрипта.

В понятие ген входят также 5’- и 3’-нетранслируемые области. В 5’-

нетранслируемой области находится основной регулятор работы гена –

промотор. Промотор – это место взаимодействия ДНК с ферментом РНК-

полимеразой, осуществляющим комплементарный синтез РНК по матрице ДНК в процессе транскрипции. Промотор определяет правильное начало транскрипции с первого инициирущего ATG-кодона и влияет на ее скорость.

Промоторы, обеспечивающие высокую скорость синтеза преРНК,

называются сильными, а низкую – слабыми. Есть промоторы, которые для своей работы требуют присутствия какой-то другой молекулы, они называются индуцибильными. Транскрипция заканчивается при достижении определенных терминирующих сигналов. В 3’-нетранслируемой области гена локализованы последовательности, участвующие в регуляции процессинга мРНК и трансляции.

Транскрипция и трансляция с образованием конечного продукта (белка или РНК) вместе называются экспрессией или работой гена. Все гены присутствуют в ядрах клеток разных специализированных тканей организма,

так как в них содержится одинаковая молекула ДНК. Однако далеко не все гены экспрессируются в разных тканях. Существует определенный набор генов, которые экспрессируются в любых типах клеток. Эти гены,

получившие название генов домашнего хозяйства, обеспечивают энергетику,

дыхание и другие процессы, без которых клетки жить не могут. Но основная

масса генов – это тканеспецифические гены, которые работают только в определенных клетках и на определенных стадиях их развития. Нарушение экспрессии генов, как правило, ассоциировано с развитием патологических процессов, лежащих в основе развития многих наследственных заболеваний.

Отклонением от нормы является не только снижение экспрессии какого-то гена или ее полное отсутствие, но и гиперэкспрессия – образование аномально большого количества продукта гена – а также эктопическая экспрессия – работа гена в несвойственном типе клеток или в несвойственный момент онтогенетического развития.

Считается, что, в среднем, в специализированных клетках одновременно работают не более 20% всех генов. Процесс дифференцировки непосредственно зависит от набора экспрессирующихся генов. Важную роль в этом играют транскрипционные факторы –

регуляторные элементы, способные активировать или репрессировать целую группу других генов, так называемую «генную сеть». Многие гены транскрипционных факторов экспрессируются в раннем эмбриогенезе и активируют «генные сети», ответственные за морфогенез отдельных органов и тканей, формирование метаболических цепей и тому подобные процессы.

Генную сеть составляют также группы генов, полиморфные функционально значимые аллели которых формируют наследственную предрасположенность к мультифакториальной патологии, такой, например, как атеросклероз,

язвенная болезнь, бронхиальная астма, рак молочной железы или простаты и др. У высших кроме промотора имеются дополнительные системы регуляции, усиливающие или ослабляющие экспрессию генов и обеспечивающие ее тканаспецифичность. Эти регуляторные последовательности, так называемые энхансеры и сайленсеры, могут находиться как в самом гене, так и на значительном расстоянии от него.

Современным интегральным методом оценки молекулярно-

генетических параметров различных типов тканей и культивируемых линий клеток, является анализ экспрессионного профиля генов, основанный на

биочиповой технологии. Подобная методология позволяет одновременно следить за работой тысяч, а иногда до десятка тысяч генов. В результате могут быть выявлены группы генов, характер экспрессии которых определяет тканеспецифичность – комплекс морфологических,

гистологических и функциональных особенностей, специфичных для определенных тканей или клеток.

Большинство генов эукариот представлено одной или несколькими копиями. Наряду с этим, некоторые гены повторены в геноме от десятка и более раз, и образуют мультигенные семейства. Эти гены обычно сгруппированы в кластеры в определенных районах одной или нескольких хромосом и часто находятся под общим регуляторным контролем.

Примерами мультигенных семейств могут служить гены рибосомальных и транспортных РНК, гены α- и β-глобинов, тубулина, миоглобина,

интерферона и многих других. Особое место среди мультигенных семейств занимают супергены – очень большие кластеры из сотен функционально и структурно родственных генов. Классическим примером супергена служит

HLA-комплекс, контролирующий главные антигены гистосовместимости. Он занимает район более 6000 тыс. п.о. на коротком плече хромосомы 6 и

состоит из серии тесно сцепленных генов, ответственных за синтез множества белков, включающих клеточные поверхностные антигены,

молекулы иммунного ответа и некоторые компоненты комплемента. К

супергенам относятся три комплекса расположенных на разных хромосомах генов, контролирующих синтез тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.

Интересно, что в процессе дифференцировки В-лимфоцитов,

продуцирующих иммуноглобулины, происходит структурная перестройка этих семейств. При этом отдельные последовательности ДНК элиминируются, тогда как другие сливаются. В итоге структура генов иммуноглобулинов в зрелых В-лимфоцитах значительно отличается от исходной, то есть той, которая наблюдается в зародышевых клетках.

Основными функциями мультигенных семейств является производство большого количества белков или РНК в ограниченный момент времени или обеспечение разнообразного ответа, как в случае HLA-комплексов или генов иммуноглобулинов. Полиморфные аллели этих генов часто являются генетическими факторами риска, предрасполагающими к широкому спектру мультифакториальных заболеваний, таких как сахарный диабет,

анкилозирующий и псориатический спондилиты, псориаз, ревматоидный

артрит, рассеянный склероз и др.

Завершая разговор, необходимо упомянуть, что в кодирующих

областях разных генов эукариот наряду с уникальными

последовательностями могут присутствовать высоко гомологичные фрагменты нуклеотидных последовательностей. Это значит, что в кодируемых такими генами белках присутствуют гомологичные фрагменты аминокислотных последовательностей, ассоциированные с определенными

идентифицировано 27 типов коллагенов. Все они состоят из трех равномерно скрученных полипептидных α-цепей, в каждой из которых присутствует специфический коллагеновый домен. На всем протяжении этого домена каждая третья аминокислота является глицином. Этот домен совершенно необходим для правильной организации коллагеновых молекул и фибрилл коллагена. Наследственные дефекты, нарушающие структуру коллагена,

приводят к широкому спектру заболеваний, получивших общее название наследственных коллагенопатий. В то же время и в других белках имеются коллагеновые домены, в частности, в сурфактант-ассоциированных белках,

дефектная структура которых является причиной развития таких тяжелых

бронхолегочных заболеваний, как респираторный дистресс-синдром,

врожденный альвеолярный протеиноз или интерстициальный альвеолит.

Другие примеры. Молекулы клеточной адгезии относятся к суперсемейству иммуноглобулинов и содержат в различных сочетаниях и количестве тандемно расположенные специфические последовательности,

так называемые Ig-подобные повторы. Однако Ig-повторы выполняют функции связывания лигандов и присутствуют в экстраклеточных доменах многих других белков, таких, например, как рецепторы фибробластных факторов роста, протеогликаны, фибулины и др. Во многих белках присутствуют последовательности, впервые идентифицированные в эпидермальном факторе роста – EGF-подобные домены. В частности, самый крупный домен фибриллина, занимающий около 75% всего белка, состоит из

46 EGF-подобных повторов, формирующих последовательности для связывания кальция и осуществления белок-белковых взаимодействий.

Напомним, что фибриллин является основным структурным компонентом эластических волокон внеклеточного матрикса, и мутации в гене фибриллина приводят к синдрому Марфана. EGF-подобные повторы присутствуют в рецепторе трансформирующего фактора роста β, тромбоспондинах – Ca2+-

связывающих гликопротеинах внеклеточного матрикса – и во многих других мультидоменных белках.

Подчеркнем еще раз, что в разных белках гомологичные домены встречаются в разных комбинациях. Так, в молекуле адгезии нейронов 5

тандемных Ig-повторов сочетаются с 6 повторами, подобными фибронектину. А фибулин – белок, располагающейся на поверхности эластических волокон – содержит 44 тандемных Ig-подобных повторов, 8

EGF-подобных повторов и 6 тромбоспондин-подобных модулей. В

фибриллине, наряду с EGF-подобными повторами содержатся мотивы для связывания интегринов и трансформирующих факторов роста. Список подобных примеров может быть значительно расширен. Таким образом,

блочная или модульная структура характерна для очень многих белков

человека, а значит и для кодирующих эти белки генов.

Модульный принцип организации регуляторных и кодирующих

последовательностей, общих для всего генома, дает широкие возможности для регуляции ансамблей генов, организованных в иерархические структуры во главе с главным геном-переключателем. При этом соподчиненные гены функционируют в разные периоды развития и могут быть интегрированы в различные «генные сети». Этот же принцип значительно облегчает создание в процессе эволюции новых генетических конструкций. При этом

важнейшими эволюционными инструментами являются дупликации,

разделения, перемещения и слияния различных фрагментов ДНК с какими-то другими структурными и регуляторными элементами. Такая перетасовка кубиками! В результате этих перестановок может меняться не только структура отдельных генов и мультигенных семейств, но и характер регуляции их экспрессии, что, безусловно, является определяющим в процессе эволюционных преобразований.

Глава 1.10. Мутации генов

Итак, материальной субстанцией наследственности являются молекулы ДНК и, в частности гены – транскрибируемые фрагменты ДНК, кодирующие белки и разнообразные молекулы РНК (рРНК, тРНК, регуляторные и другие РНК). Изменчивость определяется существованием различных состояний генов или аллелей. При этом нормальная изменчивость связана с присутствием у разных индивидуумов нормальных вариантов гена, а

патологическая изменчивость – с наличием множества мутантных аллелей или мутаций. Носители хромосомных аномалий, доминантных мутаций или гомозиготы по рецессивным мутациям называются мутантными особями или мутантами. Мутации называются «легкими» или «тяжелыми», если они ассоциированы с мягким или тяжелым течением заболевания соответственно.

Мы уже говорили о том, что мутации бывают геномными,

хромосомными или генными. В общем случае, геномные и хромосомные

мутации приводят к тяжелым патологическим состояниям, часто

несовместимым с жизнью. К геномным мутациям относятся увеличения полного набора хромосом – полиплоидии, или изменения количества

хромосом одной пары – анеуплоидии. У человека описано два вида

полиплоидий – триплоидии и тетраплоидии – трех- и четырехкратное увеличение числа гаплоидного набора. Подобные аномалии встречаются только у спонтанных абортусов или мертворожденных. Хромосомные мутации, в свою очередь, могут быть числовыми (анеуплоидии) или

структурными, то есть затрагивать число хромосом или их структуру.

Наиболее частыми числовыми аномалиями являются моносомии – отсутствие одной из гомологичных хромосом и трисомии – существование добавочной третьей копии одной из гомологичных хромосом, причем эта добавочная хромосома может быть как материнского, так и отцовского происхождения.

Трисомии найдены не для всех хромосом, и наиболее частыми из них

являются синдромы Дауна, Эдвардса и Патау – трисомии по 21, 18 и 13

хромосомам соответственно. Иногда количество добавочных хромосом может быть еще больше, эти аномалии называются полисомиями.

Моносомии и полисомии описаны, главным образом, для половых

хромосом. Другие геномные мутации несовместимы с жизнью и приводят к ранней эмбриональной гибели.

структурным перестройкам относятся делеции, инсерции, дупликации,

инверсии – соответственно отсутствие, вставка, удвоение или переворот на

1800 фрагмента одной из хромосом, а также транслокации – перенос фрагмента одной хромосомы на другую – рис. 22.

Среди структурных мутаций очень важно различать сбалансированные

и несбалансированные хромосомные перестройки. При сбалансированных

перестройках не происходит утраты генетического материала, и носители подобных мутаций, как правило, клинически здоровы. Однако в их потомстве велика вероятность рождения ребенка с несбалансированной хромосомной перестройкой, а значит, с хромосомной болезнью. Поэтому для

профилактики хромосомных болезней очень важно выявлять среди

практически здоровых людей носителей сбалансированных хромосомных перестроек. Об этом более подробно мы будем говорить в дальнейшем.

Типичным примером сбалансированных хромосомных перестроек являются

реципрокные и робертсоновские транслокации. В первом случае взаимный

обмен между участками двух хромосом происходит настолько точно, что весь генетический материал сохраняется, однако меняется расположение генов в хромосомах. В робертсоновских транслокациях участвуют только такие хромосомы, у которых центромеры локализованы на концах, так называемые акроцентрики, и именно в этих местах происходит слияние двух хромосом. В результате этого слияния в кариотипе носителя робертсоновской транслокации присутствует не 46, а 45 хромосом. Несмотря на это они здоровы. Однако у носителей как реципрокных, так и робертсоновских транслокаций повышена частота бесплодия, выкидышей и мертворождений, а также повышена вероятность рождения детей с

локализованных внутри генов. Такие мутации могут быть «легкими» или

«тяжелыми», если они ассоциированы с мягким или тяжелым течением заболевания соответственно. К числу генных или, как еще говорят, точковых мутаций относятся, в частности небольшие структурные перестройки,

затрагивающие от одного до несколько нуклеотидов или даже целых экзонов,

такие как делеции, инсерции, дупликации и инверсии. Последствия таких внутригенных перестроек зависят от протяженности нарушения, но еще в большей степени от его кратности величине кодона, то есть трем нуклеотидам. Разберем эту ситуацию на примере делеции – рис. 23.

Рисунок 22. Нарушения трансляции при делециях, кратных и не кратных трем нуклеотидам

Предположим, что величина делеции равна двум нуклеотидом. Это приведет к тому, что, начиная с места локализации этой делеции,

формирование кодонов, а значит и их трансляция в аминокислоты, будет проходить неправильно, то есть произойдет сдвиг рамки считывания. При сдвиге рамки считывания очень велика вероятность случайного формирования стоп-кодона, следствием чего будет преждевременное прекращение трансляции. Таким образом, при внутригенных структурных перестройках, не кратных трем нуклеотидам, нарушается синтез белка, очень часто происходит преждевременное прекращение трансляции, образуется укороченный белок, как правило, не защищенный от действия протеолитических ферментов, и возможна полная деградация этого белка в момент синтеза или вскоре после него. Мутации со сдвигом рамки считывания – это очень тяжелый тип нарушений, ассоциированный с серьезными патологическими последствиями. Делеции, кратные величине кодона, не приводят к сдвигу рамки считывания, и реализуются в виде локальных нарушений белка. Поэтому последствия таких мутаций оказываются менее серьезными.

Так, например, основным типом нарушений при мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера являются протяженные внутригенные делеции,

захватывающие один или несколько соседних экзонов. Подобные перестройки встречаются у 65-70% больных. Однако при тяжелой форме миодистрофии Дюшенна делеции, как правило, приводят к сдвигу рамки считывания, и у больных продукт соответствующего гена (белок дистрофин)

полностью отсутствует. При гораздо более мягкой форме миодистрофии Беккера делеции чаще всего оказываются кратны трем нуклеотидам, и

потому сдвига рамки считывания не происходит. В результате дистрофин у больных синтезируется, хотя его структура, конечно, нарушена.