МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНЕТИКА
.pdfИ, наконец, одним из вариантов компактности упаковки информации в кодирующих областях генов является альтернативный сплайсинг. Это широко распространенное явление заключается в разном вырезании интронов из одной и той же молекулы преРНК. В результате образуются разные мРНК, отличающиеся друг от друга по набору экзонов. Этот процесс носит ярко выраженный тканеспецифический характер. То есть в разных тканях один и тот же ген может по-разному прочитываться, в результате образуются тканеспецифические изоформы белков, хотя и имеющие между собой определенную гомологию, но значительно различающиеся, как по своей структуре, так и по исполняемым функциям. В частности, высоко консервативные последовательности шести последних экзонов гена DMD
альтернативно сплайсируются. В результате образуются структурно различающиеся изоформы дистрофина, осуществляющие различные функции. С учетом альтернативной транскрипции и сплайсинга количество продуктов, образующихся с одного только гена DMD достигает нескольких десятков. В настоящее время активно изучаются функции многочисленных изоформ дистрофина, обильно экспрессирующихся в различных специализированных тканях и способных взаимодействовать со множеством белков и не только мышечного или нейронального происхождения. Таким образом, в одном и том же гене может содержаться информация о структуре нескольких, а иногда даже нескольких десятков различных белков.
Не так как хромосомный геном устроен геном митохондрий. Мы уже упоминали о том, что около 5% ДНК человека находится в митохондриях -
органеллах, ответственных за энергоснабжение клетки. Митохондриальная
ДНК почти целиком состоит из генов и регуляторных элементов. В ней содержится гены транспортных и рибосомальной РНК, а также гены,
кодирующие различные субъединицы пяти комплексов окислстельного фосфорилирования. Мутации в генах митохондриальной ДНК также приводят к наследственным заболеваниям, о которых мы будем говорить в дальнейшем. В митохондриальной ДНК нет повторяющихся и уникальных
некодирующих последовательностей, так обильно представленных в хромосомной ДНК человека. Кроме того, гены митохондрий не содержат интронов. Подобным образом устроен геном бактерий. И это сходство позволяет предполагать бактериальное происхождение митохондрий.
Конечно, митохондрии не существуют сейчас в виде отдельных организмов,
иих ДНК полностью относится к элементам генома человека.
Кподобным же элементам, играющим определенную роль в функционировании генома человека, относят чужеродные и экстрахромосомные ДНК – линейные и кольцевые плазмиды, а также ДНК вирусных и бактериальных цитосимбионтов. Конечно это факультативные элементы, и их присутствие в клетках человека не является строго обязательным.
Итак, два парадокса характерны для структуры генома эукариот:
существование огромного количества «избыточных» некодирующих последовательностей ДНК, функции которых нам не всегда понятны, и
чрезвычайно компактная упаковка информации в местах локализации генов.
Подчеркнем еще раз, что структура генома также является видовым признаком. Различные индивидуумы, народы и расы не отличаются по набору и локализации не только генов, но и других элементов генома, таких как повторы, спейсерные промежутки, регуляторные последовательности,
псевдогены. Да и множества мобильных элементов генома обладают высокой видовой специфичностью. Таким образом, наследственность в широком смысле этого слова определяется структурой генома различных видов организмов. В основе внутривидовой изменчивости лежат вариации, мутации и рекомбинации генов. Эволюционная межвидовая изменчивость сопровождается структурными изменениями, происходящими на геномном уровне. Эти положения имеют важнейшее значение, в частности, для понимания молекулярной природы наследственной патологии человека.
Глава 1.14. Эпигенетическая изменчивость
В последние десятилетия произошел огромный прогресс в изучении
эпигенетической изменчивости, под которой понимают разнообразные наследуемые, хотя, возможно, и обратимые изменения экспрессии генов, не связанные с нарушением структуры генетического материала. Сейчас очевидно, что эпигенетические факторы играют значительную роль в онтогенетической дифференцировке, и нарушение этой системы ассоциировано со многими патологическими состояниями. В каждом эпигенетическом событии необходимо выделять три составляющих: (1)
сигнал, который действует на ген-переключатель, (2) восприятие сигнала рецепторной областью гена с последующим выбором одного из альтернативных режимов функционирования и (3) поддержание выбранного состояния в ряду клеточных поколений с помощью генетических или внешних факторов, таких как температура, плотность популяции, наличие симбионтов и др.
Регуляция работы многих генов осуществляется путем ДНК-белковых взаимодействий. Это относится, в частности, к контролю экспрессии генов транскрипционными факторами, обратной регуляции работы гена его продуктом или продуктами других генов при достижении ими определенных концентраций. Если под влиянием каких-то внешних воздействий произойдут изменения в подобных белках-регуляторах, их последствия будут выражаться в виде нарушения экспрессии определенных генов.
Мы уже упоминали о ключевой роли в детерминации развития градиентов белков и мРНК в цитоплазме ооцитов. Механическое повреждение морфогенетических градиентов может привести к нарушению экспрессии сотен генов. Если, в частности, подобные нарушения коснутся первичных половых клеток плода беременной женщины, то их последствия могут проявиться у внуков. То есть, эпигенетические механизмы могут привести к такой ситуации, когда условия протекания беременности у бабушки будут ответственны за возникновение наследственных нарушений у внучатого потомства.
Эпигенетические изменения могут наследоваться не только на клеточном уровне, но и на уровне целого организма. Примером могут служить, в частности, результаты, полученные в опытах П. Г. Светлова
(1965) по наследованию изменений в экспрессивности мутантных генов при однократном температурном воздействии на материнскую ооплазму. Под влиянием различных форм стресса происходят массовые перемещения мобильных элементов, следствием которых могут быть изменения в экспрессии генов, причем эти изменения часто носят наследственный характер.
На экспрессию генов влияет характер гетерохроматинизации хромосом, который зависит не только от эндогенных, но и от экзогенных факторов. Это феномен впервые был изучен А. А. Прокофьевой-
Бельговской, которая в материалах своей докторской диссертации убедительно показала, что «развитие признака в организме не определяется только наличием на участке хромосомы определенного гена, а
контролируется еще состоянием данного участка, обнаруживаемого на микроскопическом уровне, то есть находится ли этот участок хромосомы в интерфазе в деконденсированном состоянии или он конденсирован».
Активность многих белков определяется их посттрансляционными модификациями – фосфорилированием, ацетилированием, метилированием.
В частности, подобные модификации, касающиеся гистоновых белков или белков, участвующих в регуляции работы генов, могут существенно влиять на их транскрипцию. Важную роль в регуляции экспрессии генов играют пространственные взаимоотношения между генами и соответствующими регуляторными комплексами. Все эти особенности работы генов определяют хорошо известное генетикам явление, получившее название «эффект положения» - то есть разный характер фенотипического проявления гена в зависимости от его локализации в специфических районах генома. Список явлений, которые могут быть объяснены с позиций эпигенетической изменчивости, может быть продолжен.
Одним из наиболее хорошо изученных эпигенетических механизмов является метилирование ДНК, проходящее, чаще всего, по 5-му углероду цитозина. Эта модификация ДНК играет значительную роль в регуляции экспрессии генов эукариот. 5’-нетранслируемые области генов содержат последовательности, обогащенные CpG-парами, так называемые CpG-
островки. Во многих случаях инактивация гена достигается за счет метилирования этих последовательностей, причем такое состояние может стабильно поддерживаться в течение многих поколений клеток. Метильные группы нарушают взаимодействия между ДНК и белками, препятствуя тем самым связыванию транскрипционных факторов. Кроме того,
метилированные районы ДНК могут взаимодействовать с репрессорами транскрипции.
Напомним, что инактивация одной из Х-хромосом в женских соматических клетках происходит за счет ее гетерохроматинизации.
Метилирование цитозинов в гетерохроматинизированной Х-хромосоме закрепляет это состояние, которое затем устойчиво передается дочерним клеткам во всех последующих поколениях. В инактивированной Х-
хромосоме подавляющее большинство генов находятся в состоянии метилирования. Различный характер метилирования аллелей некоторых генов в мужских и женских половых клетках объясняет феномен геномного импринтинга, который заключается в разном проявлении мутантного аллеля в зависимости от его прохождения через материнский или отцовский гаметогенез. В результате избирательного метилирования определенных районов хромосом в процессе сперматогенеза или оогенеза прекращается транскрипция расположенных в этих районах генов. Предполагается, что существует не менее 100 генов, подвергающихся импринтингу, причем эти гены сгруппированы в определенных районах хромосом. В настоящее время идентифицировано более 40 таких генов. Известно влияние некоторых отцовских и материнских генов на вес плода, степень развития плаценты и другие особенности внутриутробного развития. В медицинской генетике
выделяют группу болезней геномного импринтинга, к которым, в частности,
относятся некоторые болезни экспансии. Однако обо всем этом мы будем говорить более подробно в следующих главах.
К разряду эпигенетических модификаций относится регуляция экспрессии генов молекулами РНК, которая может происходить на различных уровнях – транскрипции, процессинга преРНК, стабилизации мРНК и трансляции. К концу 90-х годов было накоплено много экспериментальных данных о присутствии в клетках различных типов РНК
(не считая тРНК и рРНК), не обладающих белок-кодирующей способностью и не транслирующихся в полипептиды. Первые указания на существование таких РНК были получены еще до открытия интронов при обнаружении многочисленного класса гетерогенных ядерных РНК (hnRNA), в 10-30 раз превосходящих по кинетической сложности класс мРНК. Определенные типы РНК могут обладать каталитической активностью (рибозимы),
связывать небольшие молекулы, такие как витамины, аминокислоты,
азотистые основания, ионы металлов (аптамеры) или иметь обе эти активности (аптазимы). Множество стабильных мРНК-подобных,
полиаденелированных и сплайсированных транскриптов не имеют открытых рамок считывания. Нельзя сбрасывать со счетов и самый многочисленный класс образующихся в процессе сплайсинга и, как оказалось, достаточно устойчивых интронных РНК, транскрибируемых синхронно с белок-
кодирующими РНК. Оказалось, что нетранслируемые РНК принимают участие в разнообразных и очень важных генетических процессах, таких как регуляция транскрипции, процессинг и модификация преРНК, поддержание стабильности и трансляции мРНК, компенсация дозы гена, импринтинг,
метилирование ДНК и ремоделирование хроматина. РНК размером от 100 до
200 нуклеотидов (sRNA) выполняют роль регуляторов трансляции в бактериальных клетках. Более протяженные РНК вовлечены в универсальную систему избирательной инактивации (silencing) генов высших.
Последнее явление, получившее название РНК-интерференция (RNAi),
было открыто случайно, когда было обнаружено, что двунитевые РНК,
инъецируемые или скармливаемые взрослым особям Caenorhabditis elegans,
действуют как триггеры, вызывая избирательную и часто наследуемую инактивацию гомологичных генов. В дальнейшем было показано, что РНК-
интерференция характерна для очень многих видов растений и животных.
По-видимому, этот общий механизм эволюционировал как система защиты от РНК-содержащих вирусов и, возможно, от мобилизации транспозонов.
РНК-интерференция включает расщепление экзогенных или эндогенных триггерных двунитевых РНК на небольшие 21-23-нуклеотидные фрагменты
(siRNA), которые в составе сложных РНК-нуклеазных комплексов действуют как каталитические кофакторы для избирательной деградации гомологичной мРНК – рис. 30.
Рисунок 30. Механизм РНК-интерференции Сходный механизм может быть вовлечен в избирательное
метилирование геномных последовательностей и ремоделирование хроматина. РНК-триггеры, гомологичные промоторным областям генов,
могут инактивировать гены на транскрипционном уровне. Экзогенные шпилечные РНК также могут вызывать деградацию гомологичных мРНК с использованием механизма РНК-интерференции. Подобные шпилечные РНК могут естественным образом экспрессироваться с инвертированных повторов или с LTR-повторов расположенных в обратной ориентации на небольшом расстоянии друг от друга. По некоторым оценкам инвертированные повторы в интронах, гомологичные экзонам других генов, встречаются в геноме человека с достаточно высокой частотой. Таким образом, РНК-
интерференцию можно рассматривать как универсальный широко распространенный механизм РНК-зависимого контроля экспрессии генов,
действующий на самых разных уровнях.
Посттранскрипционная регуляция экспрессии многих генов осуществляется путем прямой несовершенной гибридизации мРНК с
микроРНК (miRNA) – членами большого семейства некодирующих РНК размером от 19 до 25 нуклеотидов. Антисмысловые микроРНК идентифицированы у многих видов животных и растений и даже у вирусов.
У человека клонировано более 500 различных типов микроРНК, однако,
возможно, их реальное число вдвое больше. Обычно микроРНК вырезаются из более длинных предшествующих молекул со шпилечной структурой (premiRNA), которые на более раннем этапе образуются из первичных кэпированных и полиаденелированных транскриптов (pri-miRNA).
Поскольку гибридизация с 3’-нетранслируемыми районами мРНК не является совершенной, предполагается, что одна микроРНК может одновременно инактивировать более 200 различных транскриптов. Таким образом, множество микроРНК потенциально может участвовать в эпигенетическом контроле экспрессии около 30% генов человека. В
настоящее время на примере многих онкологических заболеваний показано,
что ключевая роль в индукции канцерогенеза принадлежит нарушениям в эпигенетической регуляции экспрессии онкогенов и генов супрессоров опухолей, осуществляемой микроРНК.
Таким образом, следует выделять три формы наследственной изменчивости: мутационную, вариационную и эпигенетическую, причем первые две обусловлены изменением структурных компонентов генома,
тогда как последняя – нарушением регуляции экспрессии генов.
Эпигенетическая регуляция резко увеличивает возможности взаимодействий между генами, их продуктами и факторами окружающей среды. Наряду с мутациями, вариациями и рекомбинацией, эпигенетическая изменчивость является важнейшей составляющей, обеспечивающей наследственную пластичность видов.
Глава 1.15. Геномика, проект «Геном человека»
В конце ХХ века молекулярные технологии развивались настолько интенсивно, что были созданы предпосылки для планомерного изучения структуры геномов разных видов живых существ, включая человека. Одной из наиболее значимых целей этих проектов является определение полной нуклеотидной последовательности геномных ДНК. Таким образом, родилась новая наука - геномика.
Начало нового тысячелетия ознаменовалось крупнейшим открытием в области геномики – расшифрована структура генома человека. Новость оказалась настолько значимой, что стала предметом обсуждения между президентами ведущих стран мира. Однако на многих людей это сообщение не произвело впечатления. В первую очередь это связано с недостаточным пониманием того, что такое геном, какова его структура и что значит ее расшифровка? Имеет ли эта новость отношение к медицине и может ли коснуться каждого из нас? Что такое молекулярная медицина и связана ли ее развитие с расшифровкой структуры генома? Более того, у некоторых людей возникли опасения, не грозит ли в очередной раз новое открытие ученых человечеству? Не будут ли использованы эти данные в военных целях? Не последует ли за этим всеобщее принудительное генетическое обследование -
своеобразная генетическая паспортизация населения? Не явится ли наш геном предметом анализа и насколько конфиденциальна будет полученная информация? Все эти вопросы в настоящее время активно обсуждаются в научном сообществе.
Конечно, геномика начиналась не с человека, а с гораздо более просто организованных живых существ. В настоящее время расшифрована нуклеотидная последовательность геномной ДНК многих сотен видов микроорганизмов, большинство из которых являются болезнетворными. Для прокариот полнота анализа оказалась абсолютной, то есть не остается не расшифрованным ни одного нуклеотида! В результате идентифицируются не только все гены этих микроорганизмов, но и определяются аминокислотные последовательности кодируемых ими белков. Мы уже неоднократно
отмечали, что знание аминокислотной последовательности белка позволяет довольно точно прогнозировать его структуру и функции. Открывается возможность получения антител к этому прогнозируемому белку, его изоляции из микроорганизма и прямого биохимического анализа. Давайте задумаемся, что это означает для разработки принципиально новых методов борьбы с инфекциями, если врач не только знает, как устроены гены инфицирующего микроорганизма, но и какова структура и функции всех его белков? Сейчас в микробиологии происходят грандиозные изменения в связи с появлением огромного количества новых знаний, значение которых в настоящее время мы не до конца понимаем. По-видимому, понадобятся еще десятилетия, для того чтобы приспособить эту новую информацию к нуждам человечества, в первую очередь, в области медицины и сельского хозяйства.
Переход от прокариот к эукариотам в плане расшифровки структуры генома сопровождается большими трудностями и не только потому, что длина ДНК высших в тысячи, а иногда в сотни тысяч раз больше, но и структура ее становится более сложной. Вспомним, что в геноме высших появляется большое количество некодирующих ДНК, значительную часть которых составляют повторяющиеся последовательности. Они вносят значительную путаницу в правильную стыковку уже расшифрованных фрагментов ДНК. А, кроме того, тандемные повторы сами трудно поддаются подобной расшифровке. В области локализации таких повторов ДНК может иметь необычную конфигурацию, что затрудняет ее анализ. Поэтому в геноме одного из видов микроскопического круглого червя (нематоды) -
первого многоклеточного организма, для которого удалось определить нуклеотидную последовательность ДНК, - уже осталось некоторое число неясных мест. Правда, их удельный вес составляет менее сотой процента от общей длины ДНК, и эти неясности не касаются генов или регуляторных элементов. Нуклеотидная же последовательность всех 19 099 генов этого червя, распределенных на площади в 97 миллионов пар оснований, была