Практическая работа

Р а б о т а №1

Цель:Овладеть методикой определения количества Т- и В-лимфоцитов с помощью реакции Е- и ЕАС-розеткообразования

Промикроскопировать готовые мазки Т- и В-клеток, приготовленные с целью определения количества Т- и В-лимфоцитов в реакции розеткообразования (Е-РОК и ЕАС-РОК). Оформить протокол исследования в виде рисунка. Ответить на вопросы:

1. С какой целью проводят определение Т- и В-лимфоцитов?

2. Опишите принцип метода.

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Техника постановки анализа

1. Для определения количества Т-клеток: концентрацию эритроцитов барана доводят раствором Хенкса (или средой 199) до 0,5%-ной концентрации; в силиконизированные или пластиковые пробирки объемом 1,2 мл внести 0,1 мл суспензии выделенных в градиенте лимфоцитов, доводят раствором Хенкса или средой 199 до объема 2 × 10⁶ мл; смесь инкубируют при 37°С 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 750 об/мин и инкубируют 60 мин при +12°С; после инкубации клетки фиксируют глютаровым альдегидом (0,1 мл 0,8%-ного раствора). Мазки фиксируют в метаноле (или смеси Никифорова), красят по Романовскому-Гимзе.

2. Для определения количества В-клеток: содержание лимфоцитов, выделенных в градиенте фиколл-верографина, доводят раствором Хенкса или средой 199 до 2 × 10⁶ мл; в силиконизированные или пластиковые пробирки вносят 0,1 мл лимфоцитов и 0,1 мл 0,5 %-ного раствора ЕАС комплекса (эритроциты барана, нагруженные AT в среде комплемента); смесь центрифугируют при 150 – 200 g/мин 5 мин. Образовавшиеся «розетки» фиксируют, добавляя в пробирки 0,05 мл 3%-ного раствора глютарового альдегида в фосфатном буфере. Фиксируют 20 мин при комнатной температуре и прекращают фиксацию добавлением избытка дистиллированной воды; затем клетки осаждают при центрифугировании (1000 об/мин). Надосадочную жидкость удаляют. Оставшуюся взвесь тщательно пипетируют и заносят на хорошо обезжиренное стекло, которое потом высушивают на воздухе и фиксируют 5 мин в метаноле. После окраски мазков по Романовскому-Гимзе препараты готовы для подсчета клеток. Время окрашивания – 17-20 мин в разведении 1:10.

Учет результатов

Полученные мазки Т- и В-клеток микроскопируют в иммерсионной системе микроскопа. Подсчитывают количество лимфоцитов, фиксирующих на своей поверхности 3 и более эритроцитов на 200 лимфоцитов.

Пересчет их количества на абсолютное число осуществляется по формуле:

абс кол-во Е-РОК = абс. кол-во лейкоцитов × % лимфоцитов × 10000.

Протокол

Цель:

Рис. с обозначениями

Вывод:(Ответить на вопросы: 1. Какое абсолютное число Т- и В-лимфоцитов было обнаружено? 2. Соответствуют ли полученные значения норме? 3. Объясните возможные причины отклонения от нормы?)

занятие №8:	ОБЩАЯ иммунология Контрольное занятие
УЧЕБНАЯ Цель:	Проверка знаний и умений студентов по разделу общая иммунология.

Nb! Перед зачетом возможна косметическая корректировка вопросов Вопросы для подготовки Врожденный иммунитет

1. Предмет и задачи иммунологии. История становления и развития иммунологии как науки.

2. Иммунная система. Общее понятие и определение. Центральные и периферические органы иммунной системы.

3. Определение понятия «Иммунитет» и «Иммунный ответ». Классификация видов и форм иммунитета, их общая характеристика

4. Антигены, определение, химическая природа. Классификация антигенов. Суперантигены. Антигенная структура микроорганизмов (бактерии и вирусы).

5. Врожденный иммунитет, определение, эффекторы, механизмы и функции.

6. Патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) и патоген-распознающие рецепторы (PRR), определение понятия, примеры. КлассификацияPRR.

7. Toll-likeрецепторы, история открытия и классификация. Трансдукция сигнала.

8. Воспаление как защитная реакция организма, стадии. Транссосудистая миграция лейкоцитов из кровяного русла в очаг воспаления. Понятие о хемотаксисе и молекулах адгезии.

9. Фагоцитоз, определение понятия, роль фагоцитоза в иммунной защите. Фагоцитирующие клетки их функциональные отличия. Опсонизация и рецепторы фагоцитов.

10. Общая характеристика стадий фагоцитоза (8 стадий с механизмами). Бактерицидные системы фагоцитов. Механизмы завершенного и незавершенного фагоцитоза.

11. Показатели оценки фагоцитарного звена иммунитета. Методы оценки.

12. NK-клетки, рецепторы и функции. Механизм контактного киллинга.

13. Бактерицидные пептиды (дефензины, кателицидины, лизоцим и т.д.) и их роль в естественном иммунитете. Механизмы действия на бактериальную клетку.

14. Система комплемента. Особенности альтернативного, лектинового и классического путей комплемента.

15. Альтернативный путь комплемента.

16. Классический путь комплемента.

17. Белки острой фазы. Пентраксины, лактоферрин. Роль во врожденном иммунитете.

18. Общее представление о цитокинах. Их основные группы. Цитокиновая сеть и принципы ее функционирования. Цитокиновые рецепторы (трансдукция сигнала).

19. Провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ФНО-α, ИЛ-6 и др.). Структура, клетки-продуценты, мишени, роль в иммунитете.

20. Противовоспалительные цитокины. Структура, клетки-продуценты, мишени, роль в иммунитете.

21. Интерфероны, классификация, структура, клетки-продуценты, мишени, роль в иммунитете. Препараты интреферонов I типа и интерфероногены. Примеры.

22. Апоптоз, его виды. Механизмы запуска апоптоза, роль цитокинов семейства ФНО и белков Вcl-2.