Определение микробиологической частоты нестерильных лекарственных средств, обладающих антимикробным действием

Антимикробная активность лекарственного препарата не исключает возможности его микробной загрязненности, что может быть обусловлено отсутствием самостерилизующего эффекта в отношении микроорганизмов, которые не входят в спектр его специфического действия. Например, химиотерапевтические препараты, проявляющие активность в отношении грамположительных бактерий, могут быть контаминированы грамотрицательными, антибактериальные антибиотики широкого спектра действия – грибами и т.д.

Уровень микробной загрязненности препарата зависит от типа действия (бактериостатический, бактерицидный), поступления в него микробов с приобретенной устойчивостью, наличия в составе веществ, снижающих антимикробное действие препарата.

С целью избежания ошибок в интерпретации результатов, возможных в связи с проявлением антимикробного действием лекарственного средства, перед определением микробиологической чистоты следует предварительно оценить его антимикробную активность.

Определение антимикробного действия лекарственного средства осуществляют по методике, описанной в ГФ ХI.

Пять образцов испытуемого лекарственного средства по 1г (мл) каждый разводят в соотношении 1:10, используя фосфатный буферный раствор (2 образца), среду № 3 (1 образец) и среду № 8 (2 образца). Характеристика питательных сред приведена выше.

В качестве тест-штаммов используют стандартные культуры из американской типовой коллекции культур, именуемых АТСС (American Type Culture Collection):

• Bacillus subtilis АТСС 6633;

• Escherichia coli АТСС 25922;

• Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027;

• Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р;

• Candida albicans АТСС 885-653.

Культуры S.aurens, E.coci, P.aeruginosa, B.subtilis (B.cereus) выращивают на жидкой среде № 1 при температуре 32,52,5С в течение 18-20 ч; культуру гриба C.albicans выращивают на жидкой среде Сабуро № 2 при температуре 22,5 2,5С в течение 48 ч.

Культуры разводят в соотношении 1:1000 стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида изотоническим, вносят по 1 мл в подготовленные образцы. S.aurens P.aeriginosa – в образцы , разведенные средой № 8 , E.coci – средой № 3, B.subtilis C.albicans – буферным раствором.

В случае роста тест-штаммов на соответствующих питательных средах при добавлении испытуемого лекарственного средства, его характеризуют как, "не проявляющее антимикробное действие". При последующем определении микробиологической чистоты используют вышеописанную методику прямого посева. Лекарственные средства испытывают в разведении 1:10.

При отсутствии роста тест-штаммов на питательных средах лекарственное средство характеризуют как проявляющее антимикробное действие, которое при определении микробиологической чистоты устраняют с помощью следующих способов:

• увеличивают разведение лекарственного средства, используя больший объем растворителя (1:100, 1:1000 и т.д.);

• добавляют специфический инактиватор – например, пенициллиназу для пенициллина и цефалоспоринов, соответственно от 1000 до 50000-100000 ЕД на 1мл среды;

• добавляют неспецифический инактиватор – например, 4% твин-80, 0,5% соевый лецитин;

• комбинируют способы.

В случае неэффективности вышеописанных методов используют метод мембранной фильтрации.

Определение микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств методом мембранной фильтрации

Метод мембранной фильтрации может использоваться для контроля микробиологической чистоты не стерильных лекарственных средств, обладающих выраженными антимикробными свойствами, содержащими консерванты, стерильных лекарственных форм, а также сырья и вспомогательных веществ.

Образец лекарственного средства в количестве 10 г (мл) помещают в мерный флакон, растворяют (суспендируют или эмульгируют) в фосфатном буферном растворе рН 7,0 так, чтобы конечный объем был 100 мл.

При испытании растительного лекарственного сырья к образцу в количестве 10 г приливают 100 мл фосфатного буферного раствора рН 7,0, встряхивают в течение 5 минут, а затем для фильтрации используют полученную смывную жидкость.

При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах в качестве растворителя может быть использован изопропилмиристат.

Фильтрование проводят в асептических условиях с использованием фильтрационной установки, состоящей из фильтродержателя с мембранным фильтром, соединенным с приемником. Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой и основания из пористой пластины, на которую помещают мембрану. Для водных, масляных и слабо спиртовых растворов используют нитроцеллюлозные, для сильно спиртовых – ацетатцеллюлозные полимерные мембраны с размером пор 0,450,02 мкм, диаметром 47 мм. Фильтрование проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 мм рт. ст.).

Непосредственно после приготовления образец лекарственного средства фильтруют, пропуская по 10 мл раствора через каждую из 6-ти мембран. При испытании лекарственного средства, нерастворимого в воде и образующего суспензию (таблетки, порошки и др.), производят фильтрацию надосадочной жидкости.

Вместе с микробами на фильтре остается противомикробный препарат, поэтому после окончания фильтрации мембраны отмывают 1-5 порциями по 100 мл соответствующего растворителя, например 0,9 % раствором натрия хлорида или, для жирных веществ, растворами, содержащими твин-80. Растворитель не должен подавлять рост микроорганизмов.

После отмывания мембран их извлекают из фильтродержателя и осуществляют следующие операции:

Первые две мембраны накладывают на поверхность плотной питательной среды № 1 (МПА с 1% глюкозы) в чашки Петри и инкубируют при температуре 32,5 2,5С в течение 5 суток.

Третью и четвертую мембраны накладывают на поверхность плотной питательной среды № 2 (агар Сабуро) в чашки Петри и инкубируют при температуре 22,52,5ºС в течение 5 суток.

Пятую мембрану вносят в 100 мл питательной среды № 3 и инкубируют при температуре 32,52,5С в течение 24-48 часов.

Шестую мембрану вносят в 100 мл питательной среды № 8 и инкубируют при температуре 32,52,5С в течение 24-48 часов.

Для количественного определения бактерий семейства Enterobacteriaceae две мембраны накладывают на поверхность плотной питательной среды № 4 в чашки Петри и инкубируют при температуре 32,52,5С в течение 48 часов.